1、[目的]
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)作為中國(guó)南方常見(jiàn)的一種鼻咽部腫瘤，具有難以早期診斷，易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室研究證明miR-223能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)血漿miR-223的表達(dá)和研究miR-223靶基因的功能，為鼻咽癌早期診斷以及
2、尋找新的基因治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
[方法]
(1)利用real-time PCR檢測(cè)鼻咽癌患者與健康體檢者的血漿中miR-223的表達(dá)。
(2)利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)miR-223轉(zhuǎn)染前后，鼻咽癌細(xì)胞系CNE2中的基因差異，篩選出miR-223可能的靶基因。利用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-223的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析其功能。結(jié)合以上兩種方法確定我們要研究的靶基因——MAFB，并通過(guò)real-time
3、 PCR和western blot對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
(3)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將Si-MAFB轉(zhuǎn)染入CNE-2細(xì)胞中，抑制MAFB表達(dá)。研究Si-MAFB對(duì)CNE2細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，內(nèi)容包括:CCK-8法及臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)CNE2細(xì)胞增殖能力;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察CNE2細(xì)胞的克隆形成情況;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CNE-2細(xì)胞周期分布;細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE2細(xì)胞的遷移、侵襲能
4、力;體外血管生成實(shí)驗(yàn)及ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6分泌研究CNE-2細(xì)胞血管生成情況。利用real-time PCR及westernblot從mRNA及蛋白水平檢測(cè)MAFB下游基因的表達(dá)，對(duì)MAFB的生物學(xué)功能的機(jī)制進(jìn)行研究。
[結(jié)果]
(1) miR-223在鼻咽癌初診患者血漿中表達(dá)低于健康體檢者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-223在治療后患者血漿中高于治療前患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(2)
5、表達(dá)芯片結(jié)果顯示有10個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，有11個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。Targetscan等miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到的靶基因有309個(gè)。MAFB3'UTR存在miR-223的直接調(diào)控位點(diǎn)。MAFB進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)其是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。
(3)轉(zhuǎn)染Si-MAFB入CNE2細(xì)胞24h后，MAFB表達(dá)下降至30％。通過(guò)下調(diào)CNE-2細(xì)胞的MAFB表達(dá)發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的生長(zhǎng)增殖能力減低，細(xì)胞周期G1-S期
6、阻滯，侵襲及遷移能力減弱，克隆形成能力下降，血管形成能力下降。Real-time PCR及western blot的結(jié)果顯示MAFB調(diào)控某些增殖周期，侵襲遷移及血管生成相關(guān)基因。
[結(jié)論]
血漿miR-223在鼻咽癌患者及健康體檢者體內(nèi)的表達(dá)差異，說(shuō)明其可能作為鼻咽癌診斷的生物標(biāo)記。MAFB作為miR-223的可能的靶基因，下調(diào)其表達(dá)與升高miR-223表達(dá)產(chǎn)生的功能學(xué)結(jié)果一致，所以miR-223可能通過(guò)調(diào)控