蝎毒多肽對(duì)輻射后M-NFS-60細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：放射治療是三大經(jīng)典的腫瘤治療手段之一。放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)患者體內(nèi)增殖活躍的細(xì)胞造成損傷，尤其是對(duì)射線極為敏感的造血系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，使腫瘤患者的造血和免疫系統(tǒng)功能障礙，引發(fā)多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了腫瘤治療的難度。放射損傷后，造血功能障礙的主要原因之一就是射線殺傷了維持造血功能的造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞的增殖和分化受到細(xì)胞因子（造血生長(zhǎng)因子）的調(diào)控，因此緩解輻射后造血功能抑制的常規(guī)方法是給予輻射病人細(xì)

2、胞因子治療，尤其是在放射治療后立即給予細(xì)胞因子治療以及細(xì)胞因子聯(lián)合持續(xù)給藥的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，輻射后殘存的造血干/祖細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的增殖反應(yīng)能力顯著下降；持續(xù)給予數(shù)種細(xì)胞因子聯(lián)合治療引起炎癥和免疫反應(yīng)以及其他的副作用。能否通過改善造血干/祖細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)性，促進(jìn)造血系統(tǒng)功能的自然恢復(fù)，尋找天然物質(zhì)替代細(xì)胞因子的治療，減輕治療的副作用，是血液系統(tǒng)疾病和腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。以往本實(shí)驗(yàn)室的研究表明，蝎毒多肽（SVP）不但可高選擇性

3、殺傷多種腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)帶瘤小鼠的免疫力，還可減輕放化療對(duì)骨髓造血功能抑制的副作用，具有保護(hù)輻射損傷小鼠造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞，加速其增殖能力恢復(fù)的作用。 M-NFS-60細(xì)胞為小鼠源性的造血因子依賴粒白血病細(xì)胞株，在一定程度上可反映正常造血干細(xì)胞的增殖特性。本研究采用該細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在前期研究的基礎(chǔ)上，從蝎毒多肽的多種組分中篩選促進(jìn)M-NFS-60細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的組分，并進(jìn)一步研究這些組分對(duì)輻射后M-NFS-60細(xì)胞的促增殖

4、作用及其可能的機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 材料和方法： 1.材料 1.1細(xì)胞株：M-NFS-60細(xì)胞，為依賴r-h-MCSF的小鼠粒白血病細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司（CRL-1838 TM）。 1.2 SVP：由廣州醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所分離純化贈(zèng)予，包括粗毒（C）、SVPⅠ1、SVPⅠ2、SVPⅡ1、SVPⅡ2、SVPⅡ3、SVPⅢ1、SVPⅢ2、SVPⅢ3、SVPⅣ和SVPⅤ（以下簡(jiǎn)稱Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ

5、3、Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅳ和Ⅴ）；經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后，從Ⅱ3中分離出5個(gè)組分：A1、A2、A3、A4、A5，并經(jīng)高效液相鑒定，其中A4、A5為純品。 2.方法 2.1 SVP有效組分的篩選：用AlamarBlueTM攝入法篩選SVP對(duì)M-NFS-60細(xì)胞有促增殖作用的組分，并確定其有效濃度，作為體外實(shí)驗(yàn)中SVP的使用濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期M-NFS-60細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，用含10%胎牛血清的R

6、PMI1640培養(yǎng)基（含r-h-M-CSF62ng/mL）調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cells/mL，每孔80μL加入96孔板中；分別加入10μL生理鹽水、不同濃度的SVP組分、IL-3（10ng/mL）、SVP+IL-3；每組設(shè)3個(gè)平行孔；加入AlamarBlueTM10μL，常規(guī)培養(yǎng)48h，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)各組吸光度值，再根據(jù)AlamarBlueTM方法既定公式換算出各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞增殖率。 2.2 SVP對(duì)輻射后

7、M-NFS-60細(xì)胞促增殖作用的研究：M-NFS-60細(xì)胞經(jīng)60Coγ-射線一次均勻照射，分組及實(shí)驗(yàn)方法同上。 2.3 SVP對(duì)M-NFS-60細(xì)胞周期的影響：SVP處理輻射前或輻射后M-NFS-60細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步觀察SVP對(duì)M-NFS-60細(xì)胞的促增殖作用。 2.4 SVP對(duì)IL-3R和M-CSFR表達(dá)的影響：分別用FCM、免疫熒光和Western blotting方法檢測(cè)I

8、L-3R和M-CSFR的表達(dá)水平。 2.5 SVP對(duì)磷酸化蛋白STAT5表達(dá)的影響：SVP處理M-NFS-60細(xì)胞，分別用FCM和Western blotting方法檢測(cè)磷酸化STAT5蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.SVP處理M-NFS-60細(xì)胞48小時(shí)后，在（0.5～5）mg/L的終濃度范圍內(nèi)均可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，其中Ⅱ3、Ⅳ3mg/L濃度的作用最為顯著，故選用3mg/L的SVPⅡ3、Ⅳ為體外實(shí)驗(yàn)處理組分，3mg

9、/L的SVPⅢ3為對(duì)照。純品A4、A5作用強(qiáng)于A1、A2、A3，這是本課題組首次得到的具有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖作用的蝎毒多肽純品。 2.M-NFS-60細(xì)胞經(jīng)60Coγ-射線一次均勻照射后，加入Ⅱ3、Ⅳ、Ⅲ3（3 mg/L）和IL-3（10ng/mL）以及Ⅱ3+IL-3、Ⅳ+IL-3、Ⅲ3+IL-3，作用48h，細(xì)胞的增殖率（%）分別為121.58±2.62（Ⅱ3）、123.39±4.45（Ⅲ3）、123.51±5.04（Ⅳ），14

10、0.12±1.68（IL-3），與空白對(duì)照組（100.00±0.01）相比具有顯著性差異；Ⅱ3、Ⅲ3、Ⅳ分別與IL-3聯(lián)用處理細(xì)胞48h后的增殖率分別為163.98±9.20（Ⅱ3+IL3）、159.89±8.31（Ⅳ+IL3）、148.92±9.74（Ⅲ3+IL3），與SVP處理組比較差異具有顯著性。 3.SVP可增加M-NFS-60細(xì)胞S期的百分率，使輻射后細(xì)胞阻滯在G2-M期。 4.SVP可上調(diào)M-NFS-60細(xì)胞

11、IL-3R的表達(dá)水平。在足量M-CSF維持下，對(duì)細(xì)胞MCSFR無明顯影響；在1/4濃度M-CSF維持下，可上調(diào)MCSFR的表達(dá)水平。 5.SVP處理M-NFS-60細(xì)胞后，磷酸化蛋白STAT5的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯增高。 綜上所述，SVP可保護(hù)輻射損傷M-NFS-60細(xì)胞，加速其增殖能力恢復(fù)，并且可以上調(diào)M-NFS-60細(xì)胞IL-3R和磷酸化STAT5蛋白的表達(dá)水平；提示SVP促進(jìn)輻射損傷后造血功能恢復(fù)的作用機(jī)理可能

12、與細(xì)胞因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活有關(guān)。 結(jié)論： 1.本論文結(jié)果表明，SVPⅡ3、Ⅳ、A4、A5等組分具有類細(xì)胞因子的作用，可以促進(jìn)M-NFS-60細(xì)胞的增殖，并且與IL-3具有協(xié)同促增殖作用。 2.SVP組分促M(fèi)-NFS-60細(xì)胞的增殖作用與其上調(diào)IL-3R和M-CSFR的表達(dá)有關(guān)，并可能通過JAK-STATs通路發(fā)揮作用。 3.首次分離得到了純化的SVPA4、A5，并證實(shí)它們具有類細(xì)胞因子的作用，為進(jìn)一