S100A2基因與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的功能研究.pdf

1、胃癌是消化系統(tǒng)病死率較高的惡性腫瘤之一，主要依賴手術(shù)及化療等綜合手段進(jìn)行治療，整體療效尚不滿意，對胃癌的早期診斷依然是提高患者生存率的關(guān)鍵。由于惡性腫瘤各種基因和蛋白等分子之間存在錯綜復(fù)雜的聯(lián)系，對胃癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移等機(jī)制尚無充分的認(rèn)識，腫瘤標(biāo)志物和基因治療的研究依然是胃癌研究中的難點(diǎn)。我室在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)S100A2與FAM3B基因在胃癌組織與癌旁正常組織之間的表達(dá)存在明顯的差別.本課題旨在進(jìn)一步深入了解這兩個基因在胃癌發(fā)

2、病中可能存在的作用，探討這兩個基因在細(xì)胞系中的生物學(xué)功能. 目的：研究S100A2與FAM3B基因的細(xì)胞生物學(xué)功能，探討其在胃癌發(fā)病中的意義. 方法： 1、應(yīng)用RT-PCR和Western blot以及細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)，從mRNA和蛋白水平檢測胃正常上皮細(xì)胞系GES-1與胃癌細(xì)胞系SGC7901、BGC823和MGC803等細(xì)胞系中S100A2與FAM3B的表達(dá)情況. 2、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從胃癌癌旁

3、正常組織中擴(kuò)增S100A2與FAM3B全長基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823，激光共聚焦顯微鏡觀察S100A2、FAM3B與EGFP融合蛋白在胃癌細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布. 3、經(jīng)轉(zhuǎn)染S100A2和FAM3B重組質(zhì)粒的BGC823細(xì)胞，用G418篩選獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過HE染色、MTT、穿膜實驗以及細(xì)胞周期和Cleared PARP的檢測，分析轉(zhuǎn)染目的基因細(xì)胞株與空載體細(xì)胞株在細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、運(yùn)動能力、

4、對細(xì)胞周期的影響以及細(xì)胞凋亡等方面是否存在差異，從而推測目的基因的細(xì)胞生物學(xué)功能。 結(jié)果： 1、S100A2 mRNA和蛋白在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)降低；而FAM3B mRNA和Western blot雖然在4株細(xì)胞系無明顯差異，但細(xì)胞免疫化學(xué)顯示：GES-1細(xì)胞中表達(dá)較多，BGC823表達(dá)中等，SGC7901細(xì)胞表達(dá)明顯減少. 2、從胃癌癌旁正常組織中成功擴(kuò)增出S100A2與FAM3B全長基因并克隆入真核表達(dá)載體p

5、EGFP-N2中的多克隆位點(diǎn)上，經(jīng)PCR、酶切反應(yīng)和測序證實正確。目的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，S100A2與EGFP融合蛋白分布在細(xì)胞漿內(nèi)核膜周圍，而FAM3B融合蛋白則位于細(xì)胞核內(nèi)。 3、經(jīng)過G418篩選，成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，經(jīng)Western blot檢驗證實S100A2扣FAM3B在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)增加。 4、HE染色發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞BGC823與轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后BGC823細(xì)胞

6、的細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化；轉(zhuǎn)染S100A2與FAM3B重組質(zhì)粒后，G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期和G2/M期比例降低；轉(zhuǎn)染S100A2和FAM3B重組質(zhì)粒后，BGC823細(xì)胞的增殖速度明顯降低，尤其以FAM3B基因的影響較為明顯；轉(zhuǎn)染S100A2后，細(xì)胞在單位時間內(nèi)穿過Transwell的數(shù)量明顯多于空載體組，具有顯著差異性(P＜0.05)；通過檢測PARP蛋白的被caspase切割情況，發(fā)現(xiàn)S100A2與FAM3B基因轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)

7、89KDa片段明顯增多。 結(jié)論： 1、S100A2基因在胃癌細(xì)胞系表達(dá)降低，表明該基因可能具有抑癌基因的作用。在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，但靠近核膜周圍。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長增殖速度減慢，增殖指數(shù)降低，參與細(xì)胞凋亡，但運(yùn)動能力增強(qiáng)，提示S100A2基因可能通過不同的機(jī)制參與了細(xì)胞的生長、運(yùn)動和凋亡。 2、FAM3B基因mRNA和蛋白在4株細(xì)胞系表達(dá)均較弱，雖無明顯差異，但細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)GES-1細(xì)胞系與胃癌細(xì)胞系BGC823表達(dá)