硫醇轉(zhuǎn)移酶的基因敲除及功能在白內(nèi)障發(fā)病中的研究.pdf

1、第一部分：硫醇轉(zhuǎn)移酶基因敲除小鼠模型的建立及其白內(nèi)障形成機(jī)制的研究
　　目的：
　　硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase，TTase)是維持晶狀體中氧化還原狀態(tài)的重要一員。本研究通過建立TTase基因敲除小鼠的模型，觀察晶狀體的形態(tài)和生化方面隨年齡的改變，來探討TTase在晶狀體氧化還原系統(tǒng)中的重要作用及參與年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成的主要機(jī)制。
　　方法：
　　建立TTase基因敲除小鼠模型，裂隙燈觀察比較1

2、-20月齡TTase基因敲除型和野生型小鼠的白內(nèi)障隨年齡的發(fā)生情況。比較晶狀體中谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量。采用Dionex分析儀測(cè)定晶狀體中蛋白質(zhì)谷胱甘肽二硫化物(Protein-GSH mixed disulfides，PSSG)和蛋白質(zhì)半胱氨酸二硫化物(Protein-S-S-cysteine，PSSC)的含量。Western blot使用抗-GSH抗體觀察兩種基因型小鼠的晶狀體及視網(wǎng)膜中PSSG的表達(dá)隨年齡

3、的變化。免疫共沉淀法鑒定形成PSSG的蛋白質(zhì)。觀察純化的重組人晶狀體TTase(Recombinant human lens TTase，RHLT)對(duì)PSSG的脫硫醇作用。
　　結(jié)果：
　　裂隙燈檢查結(jié)果表明，野生組和TTase基因敲除組中白內(nèi)障的發(fā)生均隨著年齡增加而增加，且混濁部位主要表現(xiàn)為核性?；蚯贸M小鼠晶狀體最早從4月齡開始發(fā)生混濁，而野生組最早從8個(gè)月開始出現(xiàn)混濁。20個(gè)月后，兩組晶狀體均發(fā)生明顯的混濁。GSH的

4、含量隨著年齡的增加而降低，20個(gè)月后均出現(xiàn)明顯降低，而基因敲除組與野生組相比沒有顯著差異。PSSG的含量隨年齡增加而緩慢增加，而12個(gè)月后基因敲除組比同年齡野生組含量較高；PSSC含量?jī)山M趨勢(shì)相同，2-12月含量較低，20個(gè)月明顯增高。Western blot表明，晶狀體中PSSG的表達(dá)也隨著小鼠年齡的增加而緩慢升高。不同年齡組兩種基因型小鼠比較，9月開始基因敲除型小鼠中 PSSG的表達(dá)高于野生型。16月時(shí)兩組PSSG的表達(dá)未見顯著差異

5、。視網(wǎng)膜中PSSG的表達(dá)也表現(xiàn)同樣趨勢(shì)。免疫共沉淀反應(yīng)證實(shí)了形成的PSSG的蛋白質(zhì)主要是肌動(dòng)蛋白（Actin）和三磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。這種聚積的二硫化物可以被GSH還原，且與純化的RHLT反應(yīng)后更有效。
　　結(jié)論：
　　結(jié)果表明TTase基因敲除可以加速小鼠年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。晶狀體中PSSG的聚積隨年齡的增加而增加，且與晶狀體

6、的混濁程度相關(guān)。證實(shí)了TTase的在保持晶狀體透明的重要作用。
　　第二部分：紫外線B誘導(dǎo)小鼠白內(nèi)障的模型及相關(guān)晶狀體形態(tài)和生化改變的研究
　　目的：
　　本研究通過建立紫外線B(UVB)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠白內(nèi)障的模型，觀察不同年齡小鼠晶狀體的形態(tài)和生化方面經(jīng)紫外線照射后的改變，來探討晶狀體抗氧化系統(tǒng)在紫外輻射引起的氧化損傷中的重要作用。
　　方法：
　　1月和16月C57BL/6小鼠給予UVB(302

7、 nm,14.4 KJ/m2)15分鐘照射，48小時(shí)后裂隙燈下觀察小鼠晶狀體變化及收集晶狀體上皮（含囊膜）。測(cè)定晶狀體中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量及三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase，TTase)的活性。Western blot觀察兩組小鼠的晶狀體中蛋白質(zhì)和GSH形成的二硫化物(Protei

8、n-GSH mixed disulfides，PSSG),TTase和硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1月和16月組均出現(xiàn)明顯晶狀體混濁，混濁部位主要表現(xiàn)為前囊膜下點(diǎn)狀混濁。晶狀體上皮中GSH的含量照射后均下降。與同年齡對(duì)照組相比，1月照射組GSH下降了10％，16月照射組下降了25％。GAPDH活性也呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)，16月照射組下降了29％，而1月照射組下降了26％。晶狀體中TTas