鹵代甲烷甲基轉移酶基因轉化煙草的研究及中華補血草LsNHXs基因的功能研究.pdf

1、第一章鹵代甲烷甲基轉移酶基因轉化煙草的研究 甲基溴是在全球被廣泛采用的一種熏蒸殺蟲劑，但是，甲基溴對臭氧層和環(huán)境有破壞作用。國際組織呼吁盡快淘汰甲基溴，因此，甲基溴替代技術的開發(fā)迫在眉睫。 鹵代甲烷的生物合成由以下酶促反應完成：SAM（S—腺苷甲硫氨酸）+X—（Cl—，Br—，r）→CH3X+S—adenosylhomocysteine（S—腺苷高半胱氨酸），反應由一種甲基轉移酶（methyl chloride tran

2、sferase MCT）催化完成。本實驗克隆了來源于甜土植物—擬南芥及來源于鹽生植物—鹽芥和鹽地堿蓬的MCT基因AtMCT（AtHOL）、ThMCT和SsMCT。通過基因工程手段將這三個基因轉入煙草，實現基因的過量表達。 土壤甲基溴熏蒸的目標在于殺死具有較高耐藥性的病源物的孢子或其他休眠形式，熏蒸所需濃度高，這也是造成環(huán)境污染的原因。通過轉基因手段，賦予轉基因煙草微量、持續(xù)產生甲基溴的能力，病源物侵染時可直接對其作用，從而替代甲

3、基溴土壤熏蒸。此技術在國內外尚屬首創(chuàng)。 主要實驗結果如下： 1）利用RT—PCR和RACE方法克隆獲得ThMCT和SsMCT基因的全長序列。ThMCT基因全長923 bp，開放閱讀框為681 bp，共編碼226個氨基酸，蛋白分子量約為25.1 KD。SsMCT基因全長1094 bp，開放閱讀框為699 bp，共編碼232個氨基酸，蛋白分子量約為25.8 KD。 2）將AtMCT、 ThMCT和SsMCT的全長OR

4、F構建到植物雙元表達載體pINT4中，用農桿菌介導的葉圓盤法轉化煙草，分別獲得了18個AtMCT．20個ThMCT和38個SsMCT基因獨立的轉化株系。 3）對轉基因植株進行分子鑒定。PCR分析、Southern和Northern雜交結果表明外源基因已整合進煙草的基因組中并正常轉錄。用總蛋白作Western雜交，三種轉基因植株均有雜交信號。但是如果主要用可溶性蛋白作Western雜交，則只有AtMCT轉基因植株有雜交信號，而Th

5、MCT和SsMCT轉基因植株均沒有雜交信號。 4）用不同濃度的處理液處理野生型和轉基因煙草，用氣/質聯用儀測定其CH3Cl、CH3Br和CH3I的釋放量。AtMCT轉基因植株a12三種氣體的釋放量明顯高于野生型對照，是對照的100倍左右，而ThMCT和SsMCT轉基因植株的釋放量和對照差異不明顯。 5）對AtMCT轉基因植株a12和野生型植株接種線蟲，在施加Br—，增加底物的情況下，AtMCT轉基因植株提高了對線蟲的抗性

6、。 第二章中華補血草LsNHXs基因的功能研究 液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白與植物耐逆密切相關，它利用液泡膜H+—ATPase及H+—PPase泵H+產生的驅動力把Na+區(qū)隔化入液泡中以消除Na+的毒害，除此之外，液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白還與PH調節(jié)、囊泡運輸、液泡的發(fā)育以及蛋白質分選有關。液泡不僅是一個物質儲存細胞器，在特定的生理條件下，某些植物細胞的液泡可參與礦質離子、簡單糖類、有機酸和氨基酸等物質的運輸。

7、 早期的電鏡觀察發(fā)現，補血草鹽腺分泌細胞內有大量的線粒體和豐富的內質網，缺少清晰的中央大液泡，但細胞內有許多液泡樣的小囊泡，小囊泡大部分都靠近細胞質膜且經常出現與質膜的融合，推測囊泡運輸參與了補血草的泌鹽過程。由此推測補血草液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白LsNHXs將對補血草的泌鹽產生一定的影響。因此，本實驗克隆了LsNHXs基因，并利用RNAi技術對其功能進行了研究。 主要實驗結果如下： 1）采用RT—PCR和3

8、’—RACE方法從補血草中克隆獲得LsNHXs基因家族三個成員LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的保守區(qū)序列以及LsNHX2和LsNHX3的3’端特異序列。 2）構建植物基因RNAi沉默表達載體并轉化補血草，獲得三個單基因和一個雙基因的RNAi沉默表達植株，快繁轉基因植株供分子鑒定和耐逆分析。 3） LsNHX1轉基因植株葉片表面分泌物中的Na+、K+離子含量比野生型對照顯著增加；葉組織內Na+離子含量和K+離子含

9、量均略高，但差異不顯著；K+/Na+比沒有顯著差異。 4） LsNHK2轉基因植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比野生型對照有所下降，但差異不顯著；K+離子含量比對照顯著降低。LsNHX2轉基因植株葉組織內Na+離子含量略高，但差異不顯著；K+離子含量和K+/Na+比均降低。 5） LsNHX3轉基因植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比對照增加，但差異不顯著，K+離子含量比對照增加，在400 mM NaCl條件下達到

10、顯著差異；葉組織內Na+離子含量和K+離子含量均略高；K+/Na+比沒有顯著差異。 6）LsNHX1+LsNHX2雙基因沉默植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比野生型對照增加，K+離子含量與野生型對照相比沒有顯著差異。轉基因植株葉中Na+離子含量略高，但差異不顯著；轉基因植株葉中K+離子含量及K+/Na+比均降低。 以上結果表明，LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的作用機制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，沉

11、默表達后，區(qū)隔化的Na+離子含量降低，導致通過囊泡運輸分泌的Na+離子含量降低。LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上，主要負責Na+的區(qū)隔化；沉默表達后，液泡中區(qū)隔化的Na+離子含量降低，胞質中的Na+離子含量增加，刺激鹽腺泌鹽，導致葉片分泌的Na+離子含量增加。 本研究的主要創(chuàng)新點： 1.首次克隆了鹽生植物—鹽芥、鹽地堿蓬的鹵代甲烷甲基轉移酶基因ThMCT和SsMCT，并對其序列特征進行了詳細的分析。

12、 2.通過過量表達鹵代甲烷甲基轉移酶基因，提高轉基因煙草釋放甲基溴的能力，使轉基因煙草微量、持續(xù)產生甲基溴，從而替代甲基溴土壤熏蒸。此技術在國內外尚屬首創(chuàng)。 3.首次克隆了補血草的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白LsNHXs基因家族三個成員LsNHK1、LsNHX2和LsNHX3的部分序列，并將這三個基因分別作了RNAi沉默表達。研究發(fā)現LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3的作用機制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，通過