青蒿鱉甲湯干預BMSCs對AMLP-CR患者BMNC來源DCs誘導的影響.pdf

1、目的：本實驗以體外培養(yǎng)的方法，將達到完全緩解標準的急性髓細胞白血病患者骨髓中分離出去T細胞的骨髓單個核細胞(TD-BMNC)、BMSCs分別與青蒿鱉甲湯含藥血清培養(yǎng)，再將與含藥血清共同培養(yǎng)過的TD-BMNC來源的DCs與BMSCs共同培養(yǎng)，觀察含藥血清對樹突狀細胞(DC)分化成熟的影響。用此法誘導分化的樹突狀細胞(DC)與純化的正常人和緩解期患者外周血T細胞共同培養(yǎng)，得到激發(fā)T細胞，用激發(fā)的T細胞與白血病細胞株(K562)共同培育，以M

2、TT法測定該T細胞對K562細胞株的殺傷活性，探討青蒿鱉甲湯能否通過干預AML-CR患者BMSCs從而對其骨髓單個核細胞來源的DC誘導作用產(chǎn)生影響。
　　 方法：1.應用洗滌細胞、離心程序在AML-CR患者的骨髓中分離出BMSCs，加入青蒿鱉甲湯不同劑量含藥血清組的25cm2培養(yǎng)瓶中，放置在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，于接種3d后首次半量換液，以后隔日換液，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況并拍照；2.應用綿羊紅細胞玫瑰花結(jié)

3、程序從AML-CR患者骨髓中分離出去T細胞的骨髓單個核細胞(TD-BMNC)，用含IO％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整TO-BMNC細胞濃度后加入24孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)9d，隔日換液1次，以不同濃度中藥含藥血清、中藥含藥血清聯(lián)合細胞因子(GM-CSF、IL-4、TNF-α)、細胞因子、空白血清組分別培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中觀察細胞的形態(tài)，并拍照。3.用FITC標記的CD29、CD44及CD-1a、HLA-DR、CD86抗體分別標記BMSCs

4、及DCs，用流式細胞儀檢測各組各抗體的表達率。4.收集培養(yǎng)9d后的BMSCs與DCs，用RPMI1640調(diào)整細胞濃度至10×106/ml混合培養(yǎng)5d；5.分別收集純化的同種異體T細胞、AML-CR患者自體T細胞、BMSCs與AML-CR患者TD-BMNC來源的DC以10:1比例加入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)5d，培養(yǎng)基中加入100U/ml的IL-2進行同種異體T細胞及自體T細胞的激發(fā)。6.激發(fā)后的各組T細胞與K562細胞分別以10:1、20:1、

5、40:1效：靶比例培養(yǎng)24h，MTT法檢測不同條件培養(yǎng)的DC誘導T細胞的殺傷效應。
　　 結(jié)果：
　　 1.用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)青蒿鱉甲湯含藥血清組、含藥血清聯(lián)合細胞因子組、細胞因子組BMSCs、DC的形態(tài)無差別。
　　 2.從BMSCs的免疫分子檢測顯示，AML-CR患者骨髓基質(zhì)細胞經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細胞表型的BMSCs，含藥血清與細胞因子在誘導CD29、CD44表達方面無協(xié)同作用，是

6、否細胞因子對BMSCs的分化無影響，是否對兔子內(nèi)環(huán)境有干預作用，均有待于進一步研究。
　　 3.從DC的免疫分子檢測顯示，AML-CR患者骨髓單個核細胞經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清誘導培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細胞表型的DC。從本實驗的總的趨勢看，青蒿鱉甲湯含藥血清配合細胞因子培養(yǎng)誘導DC，其特異性表面抗原的表達高于青蒿鱉甲湯含藥血清及細胞因子培養(yǎng)誘導的DC，說明細胞因子和青蒿鱉甲湯含藥血清在誘導TD-BMNC轉(zhuǎn)化DC上有協(xié)同作用，可能為

7、含藥血清改善了細胞因子的功能和內(nèi)環(huán)境，促進了DC的誘導、分化。
　　 4.在本實驗中，各組激活T細胞對K562細胞均有殺傷作用，各效靶比中各組別對K562細胞的殺傷率普遍優(yōu)于空白組；表明青蒿鱉甲湯干預的含藥血清誘導的DC有效的提呈了腫瘤抗原；并活化T細胞，致使它成為抗原特異性的CTL，能夠特異性的殺傷K562腫瘤細胞。青蒿鱉甲湯與細胞因子有協(xié)同作用，可能青蒿鱉甲湯含藥血清誘導、強化的骨髓基質(zhì)細胞分泌了多種的細胞因子，這些因子改變

8、了機體的內(nèi)環(huán)境，最終影響了DC細胞對K562的殺傷作用；從實驗數(shù)據(jù)來看異體T細胞殺傷率優(yōu)于自體的T細胞的殺傷率，可能是白血病腫瘤免疫逃逸機制主要是白血病緩解后患者 T細胞的細胞毒功能受損嚴重有關，有待進一步大樣本實驗研究。各組別對K562細胞均有殺傷作用，但就本實驗而言，效靶比與殺傷率之間沒有一定的規(guī)律可循，這與文獻報道的殺傷作用隨效靶比的增加而增加不符，有待以后的實驗進一步研究。
　　 5.從本實驗數(shù)據(jù)看，青蒿鱉甲湯含藥血清低

9、劑量組培養(yǎng)誘導BMSCs、DC的特異性細胞表面抗原表達率高于中、高劑量組，抗原表達不因劑量增加而升高，說明低劑量青蒿鱉甲湯含藥血清可能是此項實驗的最佳濃度，但是在各組激活T細胞對K562細胞的殺傷作用中，青蒿鱉甲湯低、中、高劑量之間的卻無一定規(guī)律可循，因此低劑量青蒿鱉甲湯含藥血清是否為最佳濃度仍有待于進一步研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性髓系白血病完全緩解患者骨髓經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清誘導培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細胞表