金槍魚降血壓肽的基因設計、克隆表達和活性評價.pdf

1、高血壓病嚴重威脅著人類的健康，已高居死亡原因的首位。食源性降血壓肽通過抑制血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)關鍵性酶一血管緊張素轉化酶(ACE)，而起到降血壓的作用，具有作用溫和、安全性高等優(yōu)點，成為目前研究熱點。從天然蛋白酶解（水解）產(chǎn)物中分離提取降血壓肽的方法工藝復雜、產(chǎn)量低，而基因工程法可以克服這些缺點，具有廣闊的發(fā)展前景。本文研究的目標是通過生物信息學和基因工程手段，采用工程菌發(fā)酵技術，大批量制備具有高活性和穩(wěn)定性的金槍魚降血壓肽Tuna AI(PT

2、HIKWGD)。主要內(nèi)容為:開發(fā)基于生物信息學平臺的小肽串聯(lián)基因設計的計算機軟件，用于降血壓肽基因的設計并分析其宿主菌環(huán)境，研究低成本重組蛋白和多肽的純化方法，對產(chǎn)品進行安全評估和活性檢測，并建立降血壓肽快速檢測方法。主要研究結果如下:
　　(1)開發(fā)了用于小肽串聯(lián)表達設計的計算機軟件《肽表達大師PeptideExpression Master》。以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，利用該軟件對Tuna AI進行串聯(lián)基因單元設計

3、，選擇甲酸作為后續(xù)重組多肽串聯(lián)體釋放多肽單體的水解體系。根據(jù)設計方案，構建了Tuna AI4拷貝基因單元，以此基因出發(fā)構建了克隆載體pUC-4nTunaAI、表達載體pET-4nTunaAI和工程菌BL21-pET-4nTunaAI（n=1、2、4和8）。工程菌經(jīng)誘導后，所有拷貝數(shù)的基因都能成功表達，表達量隨拷貝數(shù)的提高而提高，工程菌BL21-pET-32TunaAI的串聯(lián)基因表達量最高，其重組蛋白Fusion-32TunaAI的量約為

4、細胞總蛋白的45.2％。
　　(2)研究了適合重組蛋白Fusion-32TunaAI純化的超聲輔助尿素清洗方法。與表達載體提供Ni2+親和層析方法相比，此方法具有更好的純化效果（回收率提高了32.6％）。同時研究發(fā)現(xiàn)33℃、6h誘導條件下制備的重組蛋白包涵體的量只有37℃條件下（460.8 mg/L培養(yǎng)基）的58.2％，所以選擇37℃、6h作為誘導條件，以超聲輔助尿素清洗法制備的包涵體量為指標，進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗。

5、r>　　(3)研究了工程菌在5種常見的培養(yǎng)基中重組蛋白包涵體的表達情況，綜合考慮，選擇LB培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗所用的培養(yǎng)基。在LB中分別添加10 mMCa2+、Mg2+、K+和EDTA，只有Mg2+可以促進包涵體的表達。經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌，添加重組蛋白中8種高含量氨基酸（P、T、H、I、K、W、G和D）后，細胞密度均上升，但其中只有添加高稀缺系數(shù)的氨基酸（H和Y），包涵體的量才有極顯著提升。對經(jīng)IPTG誘導的大腸桿菌施加超聲處理，頻

6、率為24±2 kHz的掃頻超聲處理1.5 min對促進包涵體形成效果最好。最終優(yōu)化的培養(yǎng)基為含10mM Mg2+的LB，誘導條件為加入IPTG誘導的同時，加入10mM的色氨酸(Y)，并進行低強度掃頻超聲處理(功率強度0.095 W/cm3，頻率為24±2 kHz，時間為1.5 min)，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)6h，包涵體的量可達766.51±44.24 mg/L培養(yǎng)基。
　　(4)研究了重組多肽的低成本純化方法以及多肽活性和安全性

7、。單體重組多肽通過甲酸切割從重組蛋白Fusion-32TunaAI釋放后，依次經(jīng)透析、離子交換層析和凝膠過濾層析純化，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用和氨基酸測序確認為Tuna AI，最終產(chǎn)量為351.7 mg Tuna AI/L發(fā)酵液（純度為97％）。研究表明制備的重組多肽Tuna AI具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性。為檢測多肽內(nèi)毒素指標，以TunaAI的最大濃度（0.4 g/kg體重）灌胃小鼠ICR，12h內(nèi)實驗動物沒有出現(xiàn)因內(nèi)毒素的攝入而引起炎癥反應。以

8、此劑量連續(xù)灌胃小鼠3次，觀察7天，結果表明Tuna AI沒有明顯急性毒副作用，有較好的安全性(LD50＞1.2 g/kg)。
　　(5)研究了Tuna AI體內(nèi)降血壓試驗及其機理。一次性灌胃后，不同劑量Tuna AI能顯著地降低大鼠SHR的血壓值，并呈現(xiàn)劑量效應，而Tuna AI對正常大鼠WKyR的血壓沒有顯著性影響。高劑量Tuna AI（2.0 mg/kg體重）灌胃SHR后，降血壓效果可以維持10h，其中灌胃6h后達到最大血壓降

9、幅（36.5 mmHg），灌胃8和10h后的降血壓效果強于captopril對照。測定一次性灌胃6h后各組織ACE活性，發(fā)現(xiàn)Tuna AI主要抑制了動脈的ACE活性（抑制率為44.1％），對心、肺和血清的ACE酶活沒有明顯抑制作用，同時測得心臟的SERCA2a基因轉錄的mRNA量提升了1.2倍，動脈內(nèi)皮素的轉錄mRNA量減少了31.6％，說明給藥后，Tuna AI抑制了ACE的活性，使得AngⅡ的含量降低，進一步調(diào)控與血壓調(diào)控有關的SE

10、RCA2a基因和內(nèi)皮素基因的表達，使得血壓下降。連續(xù)35天灌胃后，大鼠SHR的血壓都有明顯下降，在給藥第2周血壓值就達到平穩(wěn)的水平，降壓最大幅度為41.6 mmHg，同樣的Tuna AI對WKyR的血壓沒有顯著性影響。連續(xù)灌胃對SHR和WKyR的體重增加量、全血指標和血清中膽固醇、葡萄糖、甘油三酯也沒有明顯的影響，但大鼠SHR的心肌酶(肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶同工酶(LDH1))分別下降了24.8％和43.0％。說明連續(xù)

11、給藥TunaAI控制血壓后，可一定程度減少因高血壓對大鼠心血管造成的損傷。
　　(6)研究建立了一種Tuna AI的ELISA快速檢測方法。將半抗原Tuna AI偶聯(lián)至牛血清白蛋白上，作為免疫原制備了抗血清?？寡褰?jīng)兩種親和柱純化，制備較高純度的多克隆抗體。利用該多克隆抗體，建立Tuna AI間接競爭ELISA的標準競爭曲線，IC50為26.34 ng/mL，檢測限LOD為0.83 ng/mL，線性范圍為1.5～364.5ng/m