基因工程法制備乳源性降血壓肽及其活性研究.pdf

1、高血壓病是人類最常見的慢性疾病之一,在全世界都有較高的發(fā)病率。據(jù)衛(wèi)生部2009年數(shù)據(jù)顯示,我國居民高血壓患病率持續(xù)增長(zhǎng),現(xiàn)有高血壓患者估計(jì)達(dá)2億人。高血壓發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜,沒有統(tǒng)一的觀點(diǎn),相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)的活性可以有效的降低高血壓患者的血壓。但目前臨床上廣泛使用的化學(xué)合成類ACE抑制劑藥物,長(zhǎng)期服用后副作用明顯。而來源于食物蛋白的ACE抑制肽因其食源性及無副作用的特點(diǎn)引起了人們的極大關(guān)注,成為目前多肽研究的熱點(diǎn)

2、之一。
　　 乳蛋白不僅是膳食蛋白質(zhì)的重要來源,來源于乳蛋白的生物活性肽的也備受關(guān)注。乳源性生物活性肽按功能可分為降血壓肽、類嗎啡活性肽、抗菌肽、免疫活性肽等。目前乳源性降血壓肽制備的方法主要有蛋白質(zhì)酶水解法和發(fā)酵法,但都存在天然原料高活性降血壓肽含量低、水解產(chǎn)物復(fù)雜、分離純化環(huán)節(jié)多、產(chǎn)量低和產(chǎn)品成本高等問題,嚴(yán)重制約了降血壓肽的產(chǎn)業(yè)化。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)降血壓肽不受原料來源限制,生產(chǎn)周期短,下游分離純化工藝簡(jiǎn)單,是克服上述困

3、難、進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的重要途徑,具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 具有高活性的乳源蛋白酶解產(chǎn)物通常為多肽混合物,包含了多種具有不同作用機(jī)理的高活性多肽成分,利用工程菌僅僅表達(dá)其中單一活性肽可能達(dá)不到很好的降血壓效果。本研究將含兩種具有不同作用機(jī)理的乳源性降血壓肽(CEI12(Phe-Phe-Val—Ala-Pro-Phe-Pro-Glu—Val-Phe-Gly-Lys)和CEI7(Ala-Leu—Pro-Met-His-Ile-Arg)

4、)的3串聯(lián)基因克隆至pET-30a載體,將重組的pET-30a載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,獲得能表達(dá)降血壓肽重組蛋白的工程菌。
　　 在工程菌胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白以不溶性的包涵體存在,只有經(jīng)過充分的細(xì)胞破碎,才能進(jìn)行有效的提取。對(duì)細(xì)胞破碎方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)探索得到的超聲輔助法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的Ni-柱親和純化法。得出最佳的純化工藝為:反復(fù)凍融破碎細(xì)胞5次,然后將破碎處理的菌體加入3 mL細(xì)胞裂解緩沖液Ⅰ使菌體重懸浮,超聲破碎2 min

5、,8000 rpm離心后取沉淀。將沉淀重懸浮于4℃、10 mL細(xì)胞裂解緩沖液Ⅱ,室溫放置5 min,4℃、8000 rpm離心后取沉淀。將沉淀懸浮于10 mL去雜液,室溫放置5 min,進(jìn)行超聲處理30 s,4℃、8000 rpm離心后取沉淀,即為純化后的重組蛋白。
　　 麥胚是小麥加工的廉價(jià)副產(chǎn)品,其蛋白質(zhì)含量達(dá)30％左右,并且含有較多疏水性氨基酸,適合工程菌發(fā)酵表達(dá)富含疏水性氨基酸的重組降血壓肽。本研究以麥胚水解物作為發(fā)酵培

6、養(yǎng)基的基礎(chǔ)原料,確定適合工程菌生長(zhǎng)和融合蛋白表達(dá)的麥胚培養(yǎng)基配方,并在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上優(yōu)化誘導(dǎo)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為:酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％,麥胚酶解物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％,葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上最佳的工程菌IPTG誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)溫度為32℃,誘導(dǎo)起始OD600為1.4,誘導(dǎo)時(shí)間為10 h。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件下,純化的包涵體含量達(dá)到535 mg／L,比2×YT進(jìn)口培養(yǎng)基的表達(dá)量提高

7、了18％。
　　 對(duì)純化的重組蛋白,加入腸激酶酶解去除N端的His融合標(biāo)簽,切下的His融合標(biāo)簽利用Ni-柱親和吸附去除,制得去融合標(biāo)簽的串聯(lián)多肽。將所得到的串聯(lián)多肽溶液加入胰蛋白酶,酶切后釋放出降血壓肽單體,通過截留分子量7000 Da的透析袋去除腸激酶和胰蛋白酶,透過液經(jīng)濃縮后用CELLUFINE GH-25柱脫鹽得到純化的乳源性降血壓肽,經(jīng)檢測(cè)CEI12和CEI7混合多肽的表達(dá)量為0.14 g／L。
　　 對(duì)乳源性

8、降血壓肽的穩(wěn)定性和活性進(jìn)行了研究,研究得出乳源性降血壓肽的IC50值為0.012 g／L,活性高于文獻(xiàn)報(bào)道的CEI12和CEI7單一成分的活性,并且具有良好的抗腸道消化酶消化的能力,且經(jīng)過蛋白酶消化后活性還略有上升。此外,乳源性降血壓肽還具有良好的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性,處理3h其ACE抑制活性仍為初始值的81％以上。原發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,高劑量組(0.8 g／kg)在一次性灌胃6 h后,收縮壓下降值達(dá)到32 mmHg左右,陽性對(duì)照