嬰兒雙歧桿菌-hDCN腫瘤靶向性基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建及對K562細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人核心蛋白聚糖（humandecorin，hDCN）原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-DCN，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到嬰兒雙歧桿菌中，待其充分表達(dá)后，取培養(yǎng)菌上清液觀察其對K562細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的作用。
　　 方法：1.采用雙酶切方法擴(kuò)增并回收DCN基因片段，利用分子重組技術(shù)構(gòu)建PGEX-4T-1-DCN原核表達(dá)載體，應(yīng)用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至雙歧桿菌，并進(jìn)行EcoRI、NotI雙酶切及測序鑒定。
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2、.轉(zhuǎn)化成功后提取上清液，處理K562細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察K562細(xì)胞增殖抑制狀況、形態(tài)改變及細(xì)胞凋亡情況。
　　 3.10％、20％和30％培養(yǎng)菌上清液作用48h后，采用流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯分析。
　　 結(jié)果：1.構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，所擴(kuò)增基因片斷與目的基因片斷大小相符；測序后與Genbank中DCN基因序列(NT029419)相比對完全相符，沒有發(fā)生突變。
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3、倒置顯微鏡下觀察到DCN目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌上清液組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙歧桿菌上清液組、單純雙歧桿菌上清液組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變。其中DCN轉(zhuǎn)化雙歧桿菌組作用下細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，可見細(xì)胞形狀不規(guī)整，并有核碎裂、凋亡小體出現(xiàn)，細(xì)胞增殖明顯減慢。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測可見，單純雙歧桿菌上清液組與轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒雙歧桿菌上清液組可誘導(dǎo)K562細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，早期凋亡率分別為11.26±1.54(％)和13.85±1.33(％)，而轉(zhuǎn)化D

4、CN的雙歧桿菌上清液組細(xì)胞凋亡率可達(dá)23.79±2.48(％)，與前兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，與對照組(5.04±0.78％)相比，G2/M期細(xì)胞比例在單純雙歧桿菌上清液組(10.56±0.81％)、空載體雙歧桿菌上清液組(12.98±1.66％)及轉(zhuǎn)化DCN雙歧桿菌上清液組(13.37±0.74％)明顯增高(P＜0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：單純雙歧桿菌上清液組和空載體雙歧桿菌上清

5、液組G0/G1期分別變現(xiàn)為(65.59±1.54％，63.89±1.24％)，相比較空白組(62.23±0.72％)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而DCN轉(zhuǎn)化雙歧桿菌上清液組G0/G1期為(72.24±0.54％)，與其他三組相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：1.成功構(gòu)建了DCN基因原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-DCN。
　　 2.應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法成功將外源性基因hDCN轉(zhuǎn)化入嬰兒雙歧桿菌中。