沉默survivin基因增強KB和KBv200對長春新堿敏感性的研究.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是許多化療藥物殺傷腫瘤的重要方式，凋亡抗性可導(dǎo)致腫瘤耐藥的產(chǎn)生。survivin是最近發(fā)現(xiàn)的抑制細胞凋亡的重要因子，可與活化的caspase-3、7和9結(jié)合并抑制其活性，使凋亡通路活化受阻，也降低了化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用，與腫瘤耐藥密切相關(guān)。研究表明，survivin在MDR株往往表達增高，可以對抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用，提示survivin在耐藥機制中具有重要作用。我們的研究顯示，survivin在口腔癌細胞KB和耐藥

2、株KBv200均有表達，且以KBv200表達較高，提示可能與口腔癌的耐藥機制有關(guān)。因此，我們擬通過RNA干擾方法沉默survivin基因，觀察對口腔癌細胞KB和耐藥株KBv200的凋亡影響，檢測兩細胞株化療敏感性的改變，以尋找提高化療敏感性的新方法。 1.方法參考LipofectamineTM2000說明書，以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。熒光顯微鏡下觀測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR法檢測細胞中survivinmRNA和mdr1mR

3、NA水平，F(xiàn)ITC熒光標記二抗法結(jié)合流式細胞儀檢測細胞中survivin蛋白水平，Hoechst33258熒光染色法觀測細胞形態(tài)，PI染色結(jié)合流式細胞儀法檢測細胞凋亡率，DiOC6染色結(jié)合流式細胞儀法檢測線粒體膜電位，caspase-3和caspase-9活性測定試劑盒檢測caspase-3和caspase-9的活性，MTT法測定腫瘤細胞生長情況和化療藥物介導(dǎo)的細胞毒作用，ChouTCandTalalay藥物量效公式分析干擾質(zhì)粒與長春新

4、堿對細胞的聯(lián)合作用，羅丹明123排出實驗檢測P-gp的泵功能。 2.結(jié)果2.1以siRNA方法沉默survivin對KB和KBv200凋亡和生長的影響mu6/survivin質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染KB和KBv200細胞，轉(zhuǎn)染效率分別為(69±5)％和(71±4)％。RT-PCR產(chǎn)物和流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示，survivin在KB和KBv200中均有表達，且以KBv200細胞中表達量較高。轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后48h，surv

5、ivinmRNA和蛋白表達均明顯下降。KB和KBv200細胞中survivinmRNA表達抑制率分別為(62±8)％和(59±6)％，蛋白表達抑制率分別為(44±5)％和(39±4)％。 轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后24h、48h、72h，KB和KBv200細胞凋亡都明顯增加，均在48h凋亡達到高峰，說明沉默survivin不僅能夠促進KB凋亡，而且也能夠促進KBv200凋亡。同時，KB和KBv200細胞的生長也被抑制。轉(zhuǎn)

6、染mu6/survivin質(zhì)粒后24h、48h、72h，KB細胞生長抑制率分別為(33±2)％、(58±3)％和(60±5)％，KBv200細胞生長抑制率則分別為(35±3)％、(45±4)％和(44±4)％。 2.2沉默survivin對KB和KBv200細胞化療敏感性的影響KB和KBv200對長春新堿的IC50分別為(0.021±0.002)μM和(1.094±0.127)μM。沉默survivin后，KB對VCR的IC50

7、降至(0.005±0.029)μM，KBv200對VCR的IC50降至(0.134±0.107)μM，說明沉默survivin基因增強了長春新堿介導(dǎo)對兩細胞株的細胞毒作用，不僅能使敏感株KB增敏，而且能使耐藥株KBv200恢復(fù)對長春新堿的敏感性。ChouTCandTalalay藥物量效公式分析干擾質(zhì)粒與長春新堿對細胞株的聯(lián)合作用，結(jié)果表明，與單獨應(yīng)用VCR相比，干擾質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用VCR對腫瘤細胞的殺傷作用明顯增強。mu6/survivin

8、質(zhì)粒與VCR的聯(lián)合化療指數(shù)CI均小于1，表明兩者合用呈協(xié)同效應(yīng)，對腫瘤的抑制作用比單獨應(yīng)用效果好。 2.3沉默survivin對凋亡途徑的影響轉(zhuǎn)染mu6/survivin質(zhì)粒后，兩株細胞caspase-3和caspase-9活性均增加，在48h達到高峰，證明沉默survivin的確能夠有效激活caspase-3和caspase-9；兩株細胞線粒體膜電位均降低，在48h達到最低，提示線粒體內(nèi)源性凋亡途徑可能參與沉默survivin

9、介導(dǎo)的凋亡。這些結(jié)果表明沉默survivin可以活化凋亡途徑，有助于提高化療藥物誘導(dǎo)的凋亡作用。 2.4沉默survivin不影響P-gp表達及功能分別沉默survivin與mdr1基因均未影響另一種基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。沉默mdr1基因能夠有效抑制KBv200細胞中P-gp的泵功能，但是沉默survivin基因?qū)-gp的泵功能沒有影響。沉默survivin后，F(xiàn)G020326作為P-gp的抑制劑，能夠進一步增強KBv200對長

10、春新堿的化療敏感性，但對缺乏P-gp表達的KB細胞株，卻幾乎沒有增敏作用。說明沉默survivin增強KBv200的化療敏感性，但是不涉及P-gp的表達改變和功能。沉默mdr1和survivin基因均能夠增強caspase-3活性，同時抑制兩者的表達，caspase-3活性被激活得更為明顯，提示聯(lián)合沉默survivin與mdr1基因可能更有利于活化凋亡通路。 3.結(jié)論1.RNA干擾方法可以有效沉默口腔癌細胞KB和KBv200中的

11、survivin基因。 2.沉默survivin不僅能夠促進口腔癌細胞親本株KB凋亡，而且能夠促進耐藥株KBv200細胞凋亡，并抑制兩種細胞的生長。 3.沉默survivin可以增強長春新堿介導(dǎo)對KB和KBv200的細胞毒作用，不但能使敏感株KB增敏，而且能提高耐藥株KBv200對長春新堿的敏感性。 4.聯(lián)合應(yīng)用survivinshRNA質(zhì)粒與長春新堿對口腔癌細胞株KB和KBv200具有協(xié)同殺傷效應(yīng)。 5