靶向Plk1的siRNA對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及增強(qiáng)長(zhǎng)春新堿化療敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：原發(fā)性肝癌是(以下簡(jiǎn)稱肝癌)，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以手術(shù)為主聯(lián)合化療、放療是目前治療肝癌的主要模式。由于肝癌對(duì)化療不太敏感，因此，如何降低化療藥物的毒性并增強(qiáng)化療效果，值得進(jìn)一步深入地研究。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因研究的進(jìn)展對(duì)肝癌進(jìn)行基因治療，為肝癌的治療提供了新的策略。 Hk1(Polo-like kinase 1)基因?qū)儆谟薪z分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶家族PlKs(Polo-like kinases)

2、中的一員，是G<,2>/M期DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)重要激酶，對(duì)中心體的成熟，雙極紡錘體的形成，及胞漿分裂等起重要作用。PR1作為參與細(xì)胞分裂啟動(dòng)和正性推進(jìn)者，在細(xì)胞增殖過(guò)程中起重要作用。在多種腫瘤中，P1k1常表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)并與不良預(yù)后密切相關(guān)。肝癌往往發(fā)生于慢性肝病，如肝硬化和慢性肝炎，這類疾病由于肝臟損傷后伴有持續(xù)的肝細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖加速使肝細(xì)胞增殖周期中的調(diào)控基因更容易發(fā)生隨機(jī)改變，同時(shí)細(xì)胞增殖加速也容易使慢性肝病過(guò)程中致病因子所導(dǎo)致的

3、DNA突變得以保留并迅速克隆性擴(kuò)張，最后導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此，我們選定PR1作為潛在的腫瘤基因治療靶點(diǎn)，調(diào)控G<,2>/M期的DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)功能，以期達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、增殖的目的。 RNA干擾(RNA interferenCe，RNAi)技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種高效地封閉特異性基因的新技術(shù)，近年來(lái)無(wú)論在功能基因組研究還是腫瘤的基因治療等方面得到廣泛的應(yīng)用。RNAi是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的Mrna發(fā)生

4、特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。因此，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的Plkl基因從而影響其生物學(xué)行為并增強(qiáng)化療藥物敏感性可能為肝癌的治療帶來(lái)新的思路。 第一章 P1k1在肝癌組織中表達(dá)及臨床意義。 目的：探討P1k1在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中的表達(dá)及其意義。 方法：用半定量RT-PCR、Western blot的方法檢測(cè)21例原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌中P1k1的表達(dá)情況，并分析其與肝癌

5、臨床病理因素的關(guān)系。同時(shí)取肝硬化及正常肝組織各7例做對(duì)照。 結(jié)果：肝癌組織中P1k1mRNA表達(dá)比值(P1k1/β-actin)為0.572±0.144，明顯高于肝硬化組織中的0.250±0.057和正常肝組織的0.218±0.073(P<0.01)。P1k1 Mrna表達(dá)水平在腫瘤直徑大于5cm組中為0.641±0.110，而在腫瘤直徑小于5cm組中為0.458±0.120，兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。其在有門(mén)靜

6、脈癌栓患者中的表達(dá)為0.652±0.107，明顯高于無(wú)門(mén)靜脈癌栓者中的表達(dá)0.522±0.144。(P<0.05)。而與有無(wú)包膜，腫瘤病理分級(jí)和AFP陽(yáng)性與否無(wú)明顯相關(guān)。肝癌組織P1k1蛋白表達(dá)明顯高于肝硬化及正常肝組織中的P1k1蛋白表達(dá)量。 結(jié)論： 1.原發(fā)性肝癌組織中P1k1mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加； 2.P1k1的表達(dá)高低與原發(fā)性肝癌的腫瘤直徑大小及脈管侵犯有明顯相關(guān)。 第二章靶向P1k1的s

7、hRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建和鑒定。 目的：構(gòu)建靶向P1k1的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)真核表達(dá)載體。 方法：設(shè)計(jì)合成兩條針對(duì)P1k1的短發(fā)夾狀RNA．及一條陰性對(duì)照無(wú)意義短發(fā)夾狀RNA，將其導(dǎo)入pGenesil-2質(zhì)粒中。用菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒測(cè)序的方法，檢驗(yàn)構(gòu)建載體的正確性。 結(jié)果：分別合成針對(duì)P1k1基因251-269及1396—1417位點(diǎn)的siRNA序列及陰性序列，成功將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體，經(jīng)

8、菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒測(cè)序，均顯示siRNA序列已成功裝入載體。 結(jié)論：構(gòu)建攜帶針對(duì)P1k1基因shRNA真核表達(dá)載體成功。 第三章靶向P1k1的siRNA對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。 目的：利用RNA(RNAi)干擾技術(shù)，研究表達(dá)P1k1的短發(fā)夾RNA(shRNA)載體對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402生物學(xué)行為的影響。 方法：根據(jù)靶基因的不同區(qū)域設(shè)計(jì)兩組shRNA以及一個(gè)陰性對(duì)照

9、，利用電穿孔法轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株BEL-7402，獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆后，半定量RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞株BEL-7402的P1k1、Cdc25C、p53mRNA的變化，Western blot檢測(cè)P1k1蛋白的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。 結(jié)果：利用電穿孔將載體轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株BEL-7402，利用G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆。半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA載體的BEL-7402細(xì)胞的P1k1表

10、達(dá)情況，P1k1siRNA-251，P1klsiRNA-1396，P1k1siRNA-hk轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組分別為0.184±0.014；0.218±0.043：0.683±0.071：0.729±0.053。檢測(cè)p53mRNA分別為0.425±0.052；0.400±0.056；0.180±0.027；0.174±0.027。檢測(cè)Cdc25C Mrna分別為0.387±0.083；0.353±0.059；0.816±0.052；0.837

11、±0.065。Western blot檢測(cè)BEL--7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA載體后的Hkl蛋白的表達(dá)分別為0.032±0.007、0.040±0.008、0.272±0.041、0.278±0.053。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shRNA載體后BEL--7402細(xì)胞增殖明顯減慢。細(xì)胞周期檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染P1k1siRNA可以引起B(yǎng)EL-7402細(xì)胞G0/G1期減少，G<,2>/CM期增高，而對(duì)S期影響不大。 結(jié)論： 1．成功篩選出

12、兩條能特異而高效抑制PRl基因表達(dá)的shRN,為進(jìn)一步研究該基因的功能和作用機(jī)制提供了新的手段； 2．用電穿孔法篩選出穩(wěn)定表達(dá)PRl siRNA的載體的BEL-7402細(xì)胞克隆，發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制Hkl Mrna的表達(dá)；并能引起p53mRNA的升高與Cdc25C Mrna的下降； 3．用電穿孔法篩選出穩(wěn)定表達(dá)PRl siRNA的載體的BEL-7402細(xì)胞克隆，發(fā)現(xiàn)其可以顯著抑制Hkl蛋白的表達(dá)； 4．BEL-74

13、02細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRl siRNA．載體后，可明顯抑制細(xì)胞增殖；改變細(xì)胞周期分布。 第四章靶向P1k1的siRNA對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞株化療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：利用RNA(RNAi)干擾技術(shù)，研究表達(dá)靶向P1k1的短發(fā)夾RNA(shRNA)載體對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402化療敏感性的影響。 方法：將P1klsiRNA-251，P1k1siRNA-1396，P1k1siRNA-hk轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的BEL

14、-7402細(xì)胞作為研究對(duì)象，用長(zhǎng)春新堿處理細(xì)胞后，用MTT法檢測(cè)四組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算IC<,60>值，流式細(xì)胞儀和Hoechest染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：長(zhǎng)春新堿處理后， P1k1siRNA-251組和P1k1siRNA-1396組與BEL7402組之間的生長(zhǎng)抑制率有顯著性差異(P<0.01)。P1k1siRNA-hk組與BEL7402組之間的生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。P1k1siRNA-251組的I

15、C<,50>為14.541ug/ml，較P1k1siRNA-hk組IC<,50>22.380ug/ml降低35.02％，較BEL7402組IC<,50>21.176 ug/ml降低31.33％；而P1k1siRNA-1396組的IC<,50>為13.413ug/ml，較P1klsiRNA-hk組IC<,50>降低40.07％，較BEL7402組IC5。降低36.66％。5ug/ml濃度長(zhǎng)春新堿作用24h后，P1k1siRNA-251組和