ALS模型鼠iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)及神經(jīng)分化研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是由于上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性導(dǎo)致延髓、四肢、軀干、胸部及腹部肌肉逐漸無(wú)力和萎縮，多因呼吸肌功能衰竭而死亡。其年發(fā)病率約為5/10萬(wàn)-7/10萬(wàn)，成年起病，患者多在首次出現(xiàn)癥狀后的3-5年內(nèi)死于呼吸衰竭，并且近年有上升的趨勢(shì)。目前尚無(wú)有效治療方法，目前唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的臨床藥物是利魯唑(riluzole)，但仍無(wú)法完全阻止疾病的進(jìn)展，僅可使ALS患者的生存期平均延長(zhǎng)3個(gè)月以上。其他的治療措施還包括維生素、神經(jīng)營(yíng)

2、養(yǎng)因子及基因治療等，但都沒有確切效果。肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確?？赡芟嚓P(guān)的因素有：突變SOD1蛋白的毒性、與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用、TDP-43蛋白、炎癥、線粒體功能異常、谷氨酸鹽興奮毒性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。目前用于ALS研究的動(dòng)物模型有多種，常用的動(dòng)物模型是SOD1突變小鼠模型，其中表達(dá)人突變SOD1-G93A(第93位甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala))的小鼠模型是迄今為止最經(jīng)典、最接近人ALS的動(dòng)物模型。其運(yùn)動(dòng)行為

3、及病理變化與人類ALS極為相似，且癥狀出現(xiàn)前已有肌電圖改變和線粒體損傷，便于ALS的早期研究。2006年8月，日本學(xué)者Shinya Yamanaka首次通過(guò)導(dǎo)入4種基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，將分化成熟的小鼠正常體細(xì)胞，重新誘導(dǎo)成為一個(gè)多功能的干細(xì)胞，具有類似胚胎干細(xì)胞的所有特性，將其命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)。07年11月，日本和美國(guó)研究人員分別利用人體皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出人類的iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、

4、基因表達(dá)狀況和表觀遺傳修飾方面都與ES細(xì)胞十分相似。這些研究明確地證實(shí)了已分化的細(xì)胞可以通過(guò)少數(shù)幾個(gè)基因的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)。iPS細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值在于獲得方法相對(duì)簡(jiǎn)單和穩(wěn)定，在技術(shù)上和倫理上都比其他方法更有優(yōu)勢(shì)。iPS細(xì)胞具有與胚體干細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，目前對(duì)于iPS細(xì)胞的神經(jīng)分化方案，與胚體干細(xì)胞的神經(jīng)分化方法類似。已經(jīng)有研究報(bào)道將鼠的iPS細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等；將人的iPS細(xì)胞分化

5、為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。但是，SOD1G93A基因突變是否會(huì)影響iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)建立，以及是否會(huì)影響iPS細(xì)胞的神經(jīng)分化尚不明確。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)的主要研究思路是，首先通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)法得到鼠尾成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生；然后對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行多能性鑒定后確認(rèn)具有胚胎干細(xì)胞特性；最后選取神經(jīng)元組織特異啟動(dòng)子的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)iPS細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)分化，對(duì)所得到的熒光細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分析。本研究主要分為兩個(gè)

6、部分：
　　 第一部分SOD1G93A小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建立及鑒定。
　　 目的：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒，通過(guò)病毒包裝技術(shù)產(chǎn)生相應(yīng)病毒，轉(zhuǎn)染SOD1G93A小鼠成纖維細(xì)胞。目的在于獲得iPS細(xì)胞并進(jìn)行多能性鑒定。
　　 方法：⑴通過(guò)組織塊貼壁法培養(yǎng)SOD1G93A小鼠的鼠尾成纖維細(xì)胞。⑵將四種表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PLAT-E細(xì)胞，收集病毒，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。⑶iPS細(xì)胞生物學(xué)特性的分析：對(duì)iPS細(xì)胞的分子標(biāo)記及體內(nèi)

7、、外分化能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：①剪鼠尾組織，培養(yǎng)得到生長(zhǎng)旺盛的鼠尾成纖維細(xì)胞。②包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒并轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞得到胚胎干細(xì)胞克隆樣的iPS細(xì)胞。③iPS細(xì)胞生物學(xué)特性：iPS細(xì)胞表達(dá)AKP、Oct4、SSEA-1，在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細(xì)胞類型。iPS細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞特性。
　　 結(jié)論：⑴誘導(dǎo)建立了SOD1G93A小鼠的iPS細(xì)胞。⑵小鼠iPS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。
　　 第二部分：Tα

8、1α-tubulin/hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染iPS細(xì)胞及神經(jīng)分化研究。
　　 目的：將神經(jīng)元組織特異性啟動(dòng)子2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞，抗性藥物篩選后進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)分化，目的在于獲得穩(wěn)定攜帶該啟動(dòng)子的小鼠ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞克隆，并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。
　　 方法：⑴將2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP的表達(dá)載體與ViraPower

9、TM LentiviralPackaging Mix共轉(zhuǎn)染239FT細(xì)胞48h至72h后，收集病毒上清液高速離心后，得到濃縮的病毒顆粒。⑵通過(guò)分次轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將慢病毒轉(zhuǎn)入小鼠E14、iPS細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天開始使用1-5μg/ml嘌呤霉素篩選7天以獲得帶有表達(dá)質(zhì)粒的純化的E14、iPS細(xì)胞。⑶加入誘導(dǎo)試劑促進(jìn)E14、iPS細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，獲得表達(dá)Tα1-α-tubulin的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行免疫組化和功能染色等的相關(guān)鑒定分析。

10、>　　 結(jié)果：①慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3天后，加入1-5μg/ml的嘌呤霉素開始篩選，觀察到有一定量的細(xì)胞死亡。篩選一周后，得到抗嘌呤霉素的攜帶外源質(zhì)粒的純化的E14、iPS細(xì)胞。②加入各種誘導(dǎo)試劑促進(jìn)iPS細(xì)胞向神經(jīng)元分化，獲得了表達(dá)Tα1-α-tubulin的綠色熒光細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞分析并分選后，經(jīng)免疫染色證實(shí)為神經(jīng)元。
　　 結(jié)論：⑴利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的iPS細(xì)胞經(jīng)過(guò)篩選獲得純化的細(xì)胞群，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化能力不受病