人iPS誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞及抗結(jié)核免疫功能檢測(cè).pdf

1、巨噬細(xì)胞(Macrophages，Mψ)是造血系統(tǒng)中最具可塑性的細(xì)胞，存在于所有的組織中，在細(xì)胞正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和對(duì)病原體的免疫反應(yīng)中扮演了許多不同的角色。結(jié)核(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的人獸共患慢性傳染病，是嚴(yán)重威脅人類健康的三大感染性疾病之一。在抗MTB感染的免疫應(yīng)答中，巨噬細(xì)胞是其主要的宿主細(xì)胞，所以研究巨噬細(xì)胞與MTB的相互作

2、用對(duì)結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展起著非常重要的作用。目前實(shí)驗(yàn)研究用人類巨噬細(xì)胞多來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系和外周血單核細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系來(lái)源的巨噬細(xì)胞容易發(fā)生遺傳結(jié)構(gòu)改變，造成功能缺失，外周血來(lái)源的巨噬細(xì)胞則獲取困難且數(shù)量較少，如何獲取大量有功能活性的巨噬細(xì)胞是研究的關(guān)鍵，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)技術(shù)的出現(xiàn)為體外獲得大量巨噬細(xì)胞提供了新思路。iPS是通過(guò)體外導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⒔K末分化的體細(xì)

3、胞重編程為具有胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES)特性的多能細(xì)胞，即能夠自我更新并可分化為3個(gè)胚層來(lái)源所有細(xì)胞的能力。iPS避免倫理道德和免疫排斥反應(yīng)等局限而備受青睞。研究已證實(shí)iPS在體外特定誘導(dǎo)條件下，能夠定向分化為巨噬細(xì)胞。iPS誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞的方法大致可以分為三類：通過(guò)iPS形成類胚體(Embryonic body，EB)；與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9，S17等共培養(yǎng)；在基質(zhì)膠上添加不同細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)分

4、化。目前，iPS來(lái)源巨噬細(xì)胞的研究大都集中在腫瘤免疫等方面，尚缺乏iPS來(lái)源的巨噬細(xì)胞在抗結(jié)核免疫機(jī)理方面的研究。
　　本研究以人iPS(human iPS，hiPS)為靶細(xì)胞，體外誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并探討了該巨噬細(xì)胞對(duì)卡介苗(BacillusCalmette-Guérin，BCG)的免疫功能。首先通過(guò)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription

5、 polymerase chain reaction，RT-PCR)，免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)，EB分化實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)hiPS進(jìn)行多能性的檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)EB形成無(wú)飼養(yǎng)層法和OP9共培養(yǎng)兩種方法誘導(dǎo)人iPS分化為巨噬細(xì)胞(iPS-Mψ)，并對(duì)無(wú)飼養(yǎng)層法來(lái)源的iPS-Mψ進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、吉姆薩染色、非特異性酯酶染色(α-NAE)、吞噬功能和細(xì)胞表面特異性抗原表達(dá)檢測(cè)等一系列鑒定。最后，利用BCG感染

6、體外培養(yǎng)iPS-Mψ，并分析BCG對(duì)iPS-Mψ一氧化氮(nitric oxide，NO)的產(chǎn)生、腫瘤壞死因子-alpha(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達(dá)情況，同時(shí)以人單核細(xì)胞系THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞（THP-1-Mψ）為對(duì)照。結(jié)果表明，hiPS經(jīng)AKP染色呈陽(yáng)性，表達(dá)Oct-

7、4和Nanog;所形成的類胚體表達(dá)內(nèi)胚層標(biāo)記基因AFP，中胚層標(biāo)記基因Gata-1和外胚層標(biāo)記基因Nestin，表明靶細(xì)胞hiPS具有多能干細(xì)胞特性，能夠用于后續(xù)分化實(shí)驗(yàn);無(wú)飼養(yǎng)層類胚體形成的方法和以O(shè)P9為飼養(yǎng)層兩種方法得到的iPS-Mψ具有巨噬細(xì)胞所特有的形態(tài)特征（圓形、橢圓形、梭形及不規(guī)則形等，部分細(xì)胞可見偽足和凸起）;進(jìn)一步對(duì)iPS-Mψ進(jìn)行特性和功能鑒定發(fā)現(xiàn)，iPS-Mψ吉姆薩染色和非特異性酯酶染色(α-NAE)染色陽(yáng)性，并具

8、有較強(qiáng)的吞噬能力，同時(shí)可檢測(cè)到特異性的表面抗原白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）CD14、CD11b、CD40、CD68和組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）MHC-Ⅱ的表達(dá)。與未感染的對(duì)照組相比，BCG感染24 h后iPS-Mψ產(chǎn)生的NO和TNF-α的表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P＜0.01)，Caspase-3的