針刺誘導(dǎo)缺血缺氧模型鼠皮層神經(jīng)干細胞增殖分化的研究.pdf

1、背景：新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是圍產(chǎn)期腦損傷的主要原因,嚴重威脅著新生兒的生命和健康，主要表現(xiàn)為中樞性運動障礙及姿勢異常，同時常伴有智力發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)困難、行為和情感異常等障礙?1-3?,是導(dǎo)致新生兒死亡或幸存者永久性神經(jīng)功能損害、智能落后的重要原因之一。降低新生兒HIE死亡率及神經(jīng)損害的發(fā)生，關(guān)鍵在于進行早期診斷、準(zhǔn)確判斷腦損傷程度，早期及時合理的治療措施。研究表明

2、磁共振擴散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)的成像技術(shù)在HIE的早期診斷、損傷程度判斷等方面具有明顯優(yōu)勢[4]。本課題組根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，以“補先天之精，調(diào)后天之本，充腦髓，壯骨，解痙”為原則，在臨床上采用針刺任脈、督脈及膀胱經(jīng)聯(lián)合治療多例各型腦癱患兒，均取得不同程度的改善甚或痊愈[5]，為早期針刺治療提供了明確的實踐證據(jù)。
　　目的：本實驗首先采用一側(cè)結(jié)扎頸總動脈結(jié)合缺氧的方法制作新生乳鼠缺血

3、缺氧腦損傷動物模型，然后應(yīng)用7.0 T高場動物核磁共振掃描儀超早期觀察并動態(tài)追蹤活體模型鼠在不同干預(yù)因素處理后腦部的改變情況，探討新生乳鼠缺血模型的評價方法，早期模擬臨床針刺任脈、督脈及膀胱行針刺治療；后期再應(yīng)用水迷宮觀察針刺前后實驗鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力變化；以期肯定針刺任脈、督脈及膀胱經(jīng)等穴位的確切療效,探討針刺療法對于HIE的預(yù)后的影響，并為針刺治療HIE的作用機理提供實驗依據(jù)。
　　方法：新生7日齡SD幼鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動脈

4、并缺氧2小時制作新生鼠缺血缺氧性腦病模型，實驗動物隨機分為正常組，模型組，針刺治療組及隨意針刺組，模型建立后第二天起予針刺治療，隨意針刺組無原則實施針刺，治療組及隨意針刺組均每天針刺一次，模型組及正常組不做針灸處理。在模型建立完成后12h內(nèi)行頭部MRI掃描，觀察模型建立成功與否以及缺血缺氧病灶累及范圍，同時測定病灶中心的表觀擴散系數(shù)（ADC值），各組大鼠在針刺治療后14天、28周和2月分別用磁共振（MRI）動態(tài)觀察其皮層發(fā)育情況，計算病

5、灶部位皮層厚度，并比較各組之間的差異。應(yīng)用GFP立體定位顯微活體注射標(biāo)記增殖分裂的細胞，并用免疫熒光觀察腦皮層神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2的表達，比較各組陽性細胞數(shù)目之間的差異。并在針刺治療后28天，水迷宮實驗觀察針刺后模型動物的行為變化，分別觀察穿越平臺次數(shù)及在目的象限停留時間這兩個敏感指標(biāo)，并比較各組之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.MRI掃描提示模型建立成功，觀看到缺血缺氧病灶累及皮層及海馬等層面,測量病灶中心區(qū)ADC值為(

6、3.351±0.094)x10-4mm2/s，低于重度缺血缺氧最終平均ADC值范圍。
　　2. MRI動態(tài)觀察缺血缺氧模型鼠腦內(nèi)皮層厚度變化情況：治療組與其他兩組實驗組不同時間段的皮層厚度對比，在針刺治療14天后，治療組與模型組、隨機針刺組比較 P<0.05；在針刺治療28天后，治療組與模型組、隨機針刺組比較 P<0.01；在針刺治療2月后，治療組與模型組、隨機針刺組比較 P<0.01,差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3. GFP轉(zhuǎn)

7、染情況：治療組中攜帶GFP陽性細胞數(shù)目比正常組、模型組及隨意針刺組明顯增多，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.免疫熒光染色情況：治療組中MAP-2陽性細胞數(shù)目比正常組、模型組及隨意針刺組明顯增多，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.在水迷宮行為學(xué)實驗中，治療組穿越平臺次數(shù)及在目的象限停留時間優(yōu)于其他兩組實驗組，P<0.05,差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：磁共振可以作為一種無創(chuàng)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)監(jiān)測手段用于超早

8、期觀察缺血缺氧腦損傷程度及病灶受累及部位、范圍，并可為針刺治療提供動態(tài)的、直觀的評估，極具臨床意義。本實驗通過大體形態(tài)、HE染色鏡下觀察及MRI掃描，縱觀三種方法所得的結(jié)果互相吻合，動物發(fā)育情況及病理染色顯示用改良的建模方法建立的動物模型腦部缺血缺氧病理變化確切，說明新生大鼠HIE模型建立成功。針刺任督二脈及膀胱經(jīng)能促進HIE模型鼠皮層及海馬神經(jīng)干細胞的增殖分裂潛能，經(jīng)治療后新生的神經(jīng)干細胞能大部分分化為神經(jīng)元，提示在缺血缺氧中喪失的神