BACE2切割KCNB1的神經(jīng)保護(hù)作用及iPS細(xì)胞來源的皮層神經(jīng)元分化模式研究.pdf

1、本文主要講述了以下幾個方面：
　　第一部分 BACE2對延遲整流鉀通道KCNB1的切割及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究
　　研究背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是神經(jīng)科最常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該病的發(fā)生與多種因素相關(guān)，如遺傳、淀粉樣β蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗等。目前普遍認(rèn)為老年斑(senile plaques，SP)是本病的特征性病理改變之一。

2、由β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursorprotein，APP)相繼被β-分泌酶和γ-分泌酶切割后形成的產(chǎn)物Aβ是SP的主要組分。
　　β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme1,BACE1)是一種跨膜的天門冬氨酸蛋白酶，其在各種組織廣泛表達(dá)，尤其在腦組織中的表達(dá)水平較高。近年來，又發(fā)現(xiàn)了與BACE1具有同源性的β-分泌酶2(β-site APP cleaving enzyme2,BAC

3、E2)。與BACE1不同，正常腦組織神經(jīng)元中BACE2表達(dá)較低，但在AD腦組織中含量較高。研究表明，BACE2可以通過切割A(yù)β以降低腦組織Aβ的沉積，因此增強(qiáng)BACE2的功能性表達(dá)可以緩解AD的病理改變。
　　延遲整流鉀電流通道KCNB1以高密度簇團(tuán)形式定位于神經(jīng)元胞體及近端樹突。KCNB1分子由六個跨膜區(qū)、胞內(nèi)N末端及C末端組成?？缒げ糠值腟1-S6形成四聚體，構(gòu)成電壓感應(yīng)部位和K+離子選擇性孔道。KCNB1胞內(nèi)N末端和C末端包

4、含75個絲氨酸，36個蘇氨酸和13個酪氨酸殘基，可以被胞內(nèi)蛋白激酶和磷酸化酶修飾。而鈣調(diào)蛋白酶可以去磷酸化KCNB1并可逆性的調(diào)節(jié)KCNB1的簇團(tuán)樣分布和功能。另外，KCNB1是氧化應(yīng)激敏感通道，氧化條件可以誘導(dǎo)內(nèi)部二硫鍵橋的形成，使通道蛋白寡聚化，從而導(dǎo)致通道失活。既往的研究證實，在老年鼠腦中KCNB1蛋白明顯氧化，而在AD患者腦中，這種氧化失活更為嚴(yán)重。此外，KCNB1亦調(diào)控細(xì)胞凋亡，沉默KCNB1或截斷KCNB1分子C末端的磷酸化

5、位點可抑制神經(jīng)元凋亡。
　　研究目的：
　　前期研究結(jié)果表明KCNB1可能是BACE2的一個新底物。本研究旨在進(jìn)一步明確BACE2切割KCNB1的氨基酸位點，并探索這種切割對KCNB1功能的影響，從而探討其在AD發(fā)病中的可能作用。
　　研究方法：
　　(1) KCNB1與BACE2過表達(dá)或敲除質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞后蛋白電泳檢測BACE2對KCNB1蛋白含量的影響;
　　(2)激光共聚焦顯微鏡觀察BAC

6、E2對KCNB1膜表達(dá)的影響;
　　(3)基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜分析檢測多肽片段的大小;在線多肽分析軟件FindPept(http://web.expasy.org/findpept/)分析切割位點;
　　(4)細(xì)胞全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)研究BACE2對KCNB1簇團(tuán)樣分布的影響;
　　(5)原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色法檢測BACE2切割KCNB1后對神經(jīng)元凋亡的影響;
　　(6)細(xì)胞膜片鉗研究BACE2切割KC

7、NB1后對神經(jīng)元電生理功能的影響。
　　研究結(jié)果：
　　(1)在HEK293細(xì)胞系中，BACE2過表達(dá)可降低KCNB1蛋白水平，敲除內(nèi)源性BACE2可增加KCNB1的表達(dá);
　　(2)免疫熒光結(jié)果示BACE2過表達(dá)降低細(xì)胞膜表面KCNB1的熒光強(qiáng)度;
　　(3)TOF-MALDI質(zhì)譜分析表明BACE2可在第375位甲硫氨酸，第716位賴氨酸及第768位酪氨酸后對KCNB1進(jìn)行切割;
　　(4)氧化應(yīng)激顯著降

8、低BACE2對KCNB1的切割效率;
　　研究結(jié)論：
　　BACE2可在第375位甲硫氨酸、第716位賴氨酸及768位酪氨酸之后切割KCNB1,切割后的KCNB1失去整流功能，與凋亡相關(guān)的鉀電流也顯著降低。本研究證實BACE2通過切割KCNB1發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分 人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞來源的大腦皮層神經(jīng)元的分化模式研究
　　研究背景：
　　哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦皮層由L1～L6六層結(jié)構(gòu)組成，

9、其發(fā)育按照“由內(nèi)而外”的復(fù)雜精細(xì)順序完成。與皮層發(fā)育有關(guān)的諸多編碼基因突變都將導(dǎo)致大腦發(fā)育異常性疾病。由于難以取得疾病特異性的腦病理標(biāo)本，目前關(guān)于本類疾病的分子病理機(jī)制研究多使用基因定點突變的鼠模型。然而，動物模型的建立不僅耗時耗力，且與實際的患病個體可能相差甚遠(yuǎn)。
　　2006年，日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組應(yīng)用表達(dá)Oct-4,Sox-2,c-Myc及Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠成纖維細(xì)胞后，得到在生物學(xué)性狀

10、方面與胚胎干細(xì)胞相類似的細(xì)胞，稱之為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cells，iPS cells)。自iPS細(xì)胞首次報道至今，其應(yīng)用已經(jīng)涉及臨床及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。iPS細(xì)胞已用于心肌再生的研究，iPS細(xì)胞分化的心肌纖維具有一定的收縮性及自律性。此外，科學(xué)家已經(jīng)成功誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞，有望通過細(xì)胞移植治療糖尿病。在腎臟研究領(lǐng)域，iPS細(xì)胞也被成功分化為腎小管上皮細(xì)胞，為iPS細(xì)胞來源的

11、腎臟再生及移植提供研究基礎(chǔ)。不僅如此，以iPS細(xì)胞為模型的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子病理研究如今是iPS細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中最熱門的領(lǐng)域?？茖W(xué)家已經(jīng)成功建立了帕金森病(Parkinson'sDisease，PD)，AD，脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA），運(yùn)動神經(jīng)元病(motor neuron disease，MND)，亨廷頓舞蹈癥（Huntington's disease，HD）等疾病特異的iPS細(xì)胞系，

12、并通過誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化為神經(jīng)元以進(jìn)一步闡明疾病的發(fā)病機(jī)制。疾病特異的iPS細(xì)胞來源的神經(jīng)元攜帶突變的致病基因，表現(xiàn)疾病特異的病理特點，故iPS細(xì)胞技術(shù)可以彌補(bǔ)神經(jīng)病理標(biāo)本難以獲取的不足。
　　盡管疾病特異的iPS細(xì)胞已逐漸應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理研究，目前尚不清楚iPS細(xì)胞來源的大腦皮層神經(jīng)元是否按照哺乳動物體內(nèi)腦皮層神經(jīng)元“由內(nèi)而外”的順序分化成熟。本研究通過免疫染色鑒定處于不同分化階段的神經(jīng)元類型以闡明iPS細(xì)胞來源的大

13、腦皮層神經(jīng)元的分化成熟模式。
　　研究方法：
　　1.人iPS細(xì)胞的建立及鑒定
　　(1)原代皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):標(biāo)本來源于流產(chǎn)胎兒的皮膚組織，采用組織貼塊法培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞;
　　(2)核轉(zhuǎn)染、iPS細(xì)胞克隆挑取及培養(yǎng):采用核轉(zhuǎn)染法將附加體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至1×106個皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi);轉(zhuǎn)染約30天后，邊緣規(guī)則的iPS細(xì)胞克隆逐漸形成，挑取邊緣清晰、GFP陰性克隆用于后續(xù)實驗。E8培養(yǎng)基用于iPS細(xì)胞的培養(yǎng)，EDT

14、A用于iPS細(xì)胞的傳代;
　　(3) iPS細(xì)胞的鑒定:采用PCR方法分析轉(zhuǎn)染的外源基因是否插入到iPS基因組。免疫熒光染色分析iPS細(xì)胞干性標(biāo)記物的表達(dá)。體外胚胎分析及體內(nèi)畸胎瘤形成試驗評估iPS細(xì)胞向三個胚層的分化潛能。
　　2.iPS細(xì)胞分化為大腦皮層神經(jīng)元
　　(1) iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(Day0～Day12):含LDN193189、XAV939及SB431542的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向

15、神經(jīng)干細(xì)胞的分化;
　　(2)神經(jīng)前體細(xì)胞分化為大腦皮層神經(jīng)元(Day13～Day80):在第13天，用Accutase消化酶將神經(jīng)前體細(xì)胞團(tuán)消化為單細(xì)胞后接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，使用含有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)元分化成熟培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞約70天，最終得到分化發(fā)育成熟的大腦皮層興奮性神經(jīng)元;
　　(3)免疫熒光染色鑒定不同分化階段（Day12,Day35及Day80）神經(jīng)元的類型;電生理記錄評價神經(jīng)元的分化成熟度。

16、
　　研究結(jié)果：
　　(1)人iPS細(xì)胞的建立及鑒定:核轉(zhuǎn)染的皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)過約30天的培養(yǎng)可形成iPS細(xì)胞克隆。生長克隆呈圓形，邊緣清晰，折光性好，免疫染色鑒定iPS細(xì)胞表達(dá)OCT4、SOX2、Nanog、SSEA4及TRA1-60等干性標(biāo)記。PCR檢測證實外源基因未插入到iPS細(xì)胞基因組。核型分析示細(xì)胞染色體正常。體外胚胎分析及體內(nèi)畸胎瘤形成試驗證實iPS細(xì)胞具有向三個胚層分化的能力。
　　(2)神經(jīng)元誘導(dǎo):iP

17、S細(xì)胞經(jīng)過12天的神經(jīng)元誘導(dǎo)形成高表達(dá)FOXG1、PAX6、OTX1及SOX1等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記的神經(jīng)前體細(xì)胞，并可見較多的神經(jīng)花環(huán)(Neural Rosette)結(jié)構(gòu);在第35天，神經(jīng)元發(fā)育分化逐漸成熟，形成位于L6及SP的TBR1+神經(jīng)元，但尚不能檢測到位于L5的CTIP+神經(jīng)元;在第80天，位于L5-L2的皮層興奮性神經(jīng)元（L5的CTIP2+神經(jīng)元，L3及L2的CUX1+或SATB2+神經(jīng)元）逐漸分化成熟。對處于第35天，第55天及

18、第80天的神經(jīng)元進(jìn)行動作電位檢測，結(jié)果表明隨著神經(jīng)分化發(fā)育的不斷成熟，神經(jīng)元產(chǎn)生的動作電位逐漸增多。
　　研究結(jié)論：
　　我們通過附加體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法建立了無外源基因整合的人iPS細(xì)胞系。所建立的iPS細(xì)胞核型正常，表達(dá)良好的干細(xì)胞標(biāo)記，具有向三個胚層分化的特性。iPS細(xì)胞經(jīng)過約80天的神經(jīng)元誘導(dǎo)及分化，按照與哺乳動物體內(nèi)皮層神經(jīng)元相似的分化成熟模式（即“由內(nèi)而外”的順序）分化成熟為大腦皮層興奮性神經(jīng)元。iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)元