氟西汀對(duì)Il-1β誘導(dǎo)的小鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)炎癥是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制之一，參與缺血性腦卒中、神經(jīng)退行性病變、抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及白介素-6(interleukelin-6，IL-6)等炎癥因子以不同方式誘導(dǎo)神經(jīng)損傷?？寡字委熞呀?jīng)探索性地應(yīng)用于腦卒中、癲癇以及阿爾茲海默病(Alzheimer's diseas

2、e，AD)中。因此在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療策略中，尋找有效的抗神經(jīng)炎癥靶點(diǎn)以及有力的神經(jīng)保護(hù)劑顯得尤為重要。
　　氟西汀(Fluoxetine)是一種經(jīng)典的選擇性5-羥色胺(Serotonin，5-HT)再攝取抑制劑（Selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）。除了抗抑郁癥作用外，氟西汀尚有顯著的抗炎、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，氟西汀對(duì)缺血性腦卒中患者以及腦卒中模型動(dòng)物均具有

3、神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明氟西汀減少缺血性腦卒中模型大鼠腦梗死體積并降低其神經(jīng)功能評(píng)分。此外，氟西汀減少缺血性腦卒中模型大鼠腦內(nèi)TNF-α和IL-1β的釋放、抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)活性、抵抗生物胺的丟失。氟西汀對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用可能與其抗炎、抗凋亡作用相關(guān)，但其確切機(jī)制尚未闡明。
　　p53是一種腫瘤抑制基因。野生型p53蛋白由373個(gè)氨基酸組成，包括四個(gè)功能域:①N端功能域，又分

4、為轉(zhuǎn)錄活化區(qū)和脯氨酸富集區(qū);②DNA結(jié)合域，負(fù)責(zé)與DNA序列的結(jié)合;③寡聚化結(jié)構(gòu)域;④C端調(diào)控域，大部分的轉(zhuǎn)錄后修飾均發(fā)生于此。生理?xiàng)l件下，由于鼠雙微基因2(Mouse double minute2homolog，MDM2)的泛素化作用及蛋白酶體的降解，p53低水平表達(dá)。一旦發(fā)生DNA損傷，雙鍵斷裂促進(jìn)FOXO3a、E2F1、YB1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使ATM或ATR分別活化CHK2和CHK1，進(jìn)而活化p53，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)（尤其

5、是凋亡蛋白Bax的表達(dá)）。p53功能廣泛，參與細(xì)胞周期阻滯、凋亡、老化、DNA損傷修復(fù)等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)p53也參與神經(jīng)精神疾病的發(fā)生、發(fā)展，如缺血性腦卒中、神經(jīng)退行性病變、抑郁癥以及癲癇等。例如，在缺血性腦卒中模型中，p53通過(guò)死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase1，DAPK1)信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。炎癥因子，尤其是IL-1β，通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)

6、位，進(jìn)而活化p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53-upregulated modulator of apoptosis，PUMA），后者促進(jìn)p53與Bcl-XL解離。游離的p53活化Bax，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。上述研究提示p53可能參與調(diào)控氟西汀的抗凋亡作用，然而其在氟西汀對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用中的意義尚未見報(bào)道。
　　本文通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)研究氟西汀的神經(jīng)保護(hù)作用與p53的相關(guān)性及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀抑制短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞(

7、Transient middle cerebralartery occlusion，tMCAO)模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡、IL-1β釋放及p53表達(dá)下降。離體培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元以及N2a細(xì)胞株，進(jìn)一步離體研究發(fā)現(xiàn)氟西汀通過(guò)p38-p53信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本文工作證實(shí)了氟西汀對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用，并揭示了p53在其中的重要意義和調(diào)控機(jī)制，深化了對(duì)氟西汀藥理作用的認(rèn)識(shí)，為氟西汀治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。

8、　　目的:
　　研究氟西汀對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用及其與p53的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.氟西汀對(duì)小鼠腦缺血再灌注急性期損傷的治療作用。
　　應(yīng)用3月齡C57BL/6J雄性小鼠，建立tMCAO模型，缺血1h，復(fù)灌1h后腹腔注射(i.p.，bid.)氟西?。?0 mg/kg）。24 h后行神經(jīng)功能評(píng)分，TTC染色測(cè)定腦梗死體積，免疫組織化學(xué)計(jì)算N euN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，TUNEL法觀察凋亡細(xì)胞，Western B

9、lot檢測(cè)Bax、Bcl-2、p53、IL-1β及proIL-1β蛋白表達(dá)。
　　2.氟西汀對(duì)原代皮層神經(jīng)元的抗凋亡作用。
　　(1)離體培養(yǎng)小鼠原代皮層神經(jīng)元，氟西汀（0.1、1、10μM）預(yù)處理1h后，給予IL-1β(30 ng/ml)刺激24 h。應(yīng)用Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡，顯微鏡明場(chǎng)觀察神經(jīng)元突起，LDH法檢測(cè)細(xì)胞活力，Western Blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、NF-κB、p53蛋白表達(dá)，

10、Real-time PCR檢測(cè)p53 mRNA表達(dá)，細(xì)胞免疫化學(xué)觀察p53分布。(2)離體培養(yǎng)小鼠原代皮層神經(jīng)元，cyanopindolol(10μM)或酮舍林(1μM)預(yù)處理30min后，給予上述相同藥物刺激。應(yīng)用Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡，Western Blot觀察Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化。
　　3.氟西汀通過(guò)p38-p53信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用。
　　(1)培養(yǎng)N2a細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染pcDNA3.

11、1(-)-3HA-p53，氟西汀(1μM)預(yù)處理1h后，給予IL-1β(30 ng/ml)刺激24 h。應(yīng)用Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡，LDH法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡，Western Blot觀察Bax、Bcl-2、NF-κB、p53蛋白表達(dá)。(2)培養(yǎng)N2a細(xì)胞株，氟西?。?μM）預(yù)處理1h后，給予茴香霉素(10nM)或SB203580（10μM）刺激11h。WesternBlot觀察MAPK、p53蛋

12、白表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)p53、FOXO3a mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.氟西汀改善小鼠腦缺血再灌注急性期損傷。
　　氟西汀(40mg/kg，i.p.，bid.)顯著改善tMCAO導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙，減小腦梗死體積，抑制神經(jīng)元丟失，緩解細(xì)胞凋亡，抑制IL-1β釋放。
　　2.氟西汀減少IL-1β導(dǎo)致的原代皮層神經(jīng)元凋亡和炎癥。
　　離體培養(yǎng)小鼠原代皮層神經(jīng)元，氟西?。?μM）預(yù)處理1h

13、，顯著抑制IL-1β(30 ng/ml)導(dǎo)致的神經(jīng)元突起縮短、LDH釋放、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞凋亡、NF-κB信號(hào)通路活化。
　　3.氟西汀通過(guò)抑制p38-p53信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗凋亡及抗炎作用
　　氟西汀下調(diào)原代皮層神經(jīng)元和N2a細(xì)胞株p53表達(dá)。p53過(guò)表達(dá)取消氟西汀的抗炎及抗凋亡作用。氟西汀下調(diào)p53的同時(shí)伴隨抑制p38磷酸化。p38激動(dòng)劑茴香霉素可取消氟西汀對(duì)p53的下調(diào)作用。反之，p38抑制劑SB203580可模擬氟

14、西汀對(duì)p53的下調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　1.氟西汀抗炎和對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用與調(diào)節(jié)p53表達(dá)相關(guān)。
　　2.氟西汀通過(guò)抑制p38磷酸化調(diào)節(jié)p53。
　　綜上所述，本文工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:
　　1.證實(shí)氟西汀改善缺血再灌注急性期損傷本文研究發(fā)現(xiàn)氟西汀急性期用藥顯著減輕小鼠神經(jīng)功能障礙、腦梗死體積、神經(jīng)元丟失及細(xì)胞凋亡，提示氟西汀顯著改善缺血再灌注急性期損傷，為氟西汀用于腦卒中急性期治療提供實(shí)驗(yàn)基