SiRNA干擾MAS基因?qū)π∈驧S-1細胞功能及增殖的影響.pdf

1、【目的】：
　　胰島微循環(huán)中胰島內(nèi)皮細胞與β細胞相互毗鄰,相互依存。內(nèi)皮細胞不但參與構成胰島微循環(huán),為β細胞的生存提供物質(zhì)基礎,而且還能分泌多種細胞因子,影響β細胞的功能和狀態(tài)。新近發(fā)現(xiàn)的ACE2-Ang1-7–Mas通路能拮抗經(jīng)典RAS途徑ACE-AngⅡ-AT1R通路的作用,發(fā)揮血管舒張,抗氧化應激及改善內(nèi)皮功能等作用。在胰腺的內(nèi)分泌組織中已發(fā)現(xiàn)完整的局部RAS系統(tǒng)。MAS受體是Ang1-7的內(nèi)源性受體,其主要分布于胰島內(nèi)皮細

2、胞。為了進一步研究胰島內(nèi)ACE2-Ang1-7–Mas路徑的功能及其對內(nèi)皮細胞功能的作用,本研究采用siRNA干擾技術沉默胰島微循環(huán)內(nèi)皮MS-1細胞的MAS基因,以觀察探究其對MS-1細胞的功能及增殖的影響。
　　【方法】:
　　化學合成針對MAS基因的3對siRNA,用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000將其轉(zhuǎn)染至小鼠胰島微循環(huán)內(nèi)皮細胞MS-1細胞中。應用FCM檢測FAMsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細胞后轉(zhuǎn)染效率,實時熒光

3、定量PCR檢測MASsiRNA轉(zhuǎn)染后的抑制效率,以及反映內(nèi)皮功能eNOS,ICAM-1,VCAM-1的mRNA的表達。蛋白質(zhì)印跡法檢測eNOS的蛋白表達,cck8(cellcountingkit-8)法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖情況,FCM檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖指數(shù)PI的變化。
　　【結(jié)果】:
　　FCM檢測FAMsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細胞后轉(zhuǎn)染效率79.41％。與空白對照組相比,MASsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細胞后,其MAS抑制效率為7

4、8%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與未轉(zhuǎn)染組相比,eNOSmRNA的表達下降了18.36%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。eNOS的蛋白水平未見顯著改變。ICAM-1,VCAM-1的表達與未轉(zhuǎn)染組相比,其mRNA的表達有上升的趨勢,但是無統(tǒng)計學差異。PI檢測顯示MASsiRNA轉(zhuǎn)染MS-1細胞后,細胞PI明顯增加(P<0.05)。CCK-8檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性,與對照組相比,MS-1細胞增殖活性增加(P<0.05)。