siRNA干擾成纖維細(xì)胞Caveolin-1基因表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、研究背景及目的
　　乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一,已經(jīng)成為城市女性健康的第一殺手。人類對(duì)乳腺癌的相關(guān)研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展,但是乳腺癌的發(fā)病誘因及影響因素非常復(fù)雜,目前對(duì)其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制仍知之甚少。Caveolin-1蛋白是構(gòu)成細(xì)胞胞膜窖(caveolae)的主要蛋白,它對(duì)聚集在caveolae的分子具有調(diào)控作用。Caveolin-1與乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),正常情況下,Caveolin-1主要在乳腺基

2、質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)豐富,而在慢性乳腺炎、乳腺纖維增生及其惡性轉(zhuǎn)化微環(huán)境中的基質(zhì)成纖維細(xì)胞Caveolin-1下降甚至陰性。臨床Caveolin-1下降或陰性的乳腺癌病人,預(yù)后差,生存率低,乳腺癌晚期病人Caveolin-1均為陰性,而乳腺癌 Caveolin-1陽性的病人,預(yù)后好,生存率高,89％Caveolin-1陽性的乳腺癌患者在 l5年的隨訪時(shí)間內(nèi)未發(fā)生復(fù)發(fā)。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體對(duì)細(xì)胞器及蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的生物學(xué)過程,自噬活

3、性改變與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如炎癥、細(xì)胞功能失調(diào)、神經(jīng)變性疾病、自身免疫病、惡性腫瘤和衰老等。腫瘤惡變微環(huán)境觸發(fā)成纖維細(xì)胞上調(diào)自噬基因的表達(dá)可能是成纖維細(xì)胞異常激活事件,使成纖維細(xì)胞的自噬功能異常,如自噬自身產(chǎn)生的功能蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白,通過自噬降解大分子給癌前細(xì)胞補(bǔ)充營養(yǎng),并通過自噬改變細(xì)胞的分泌功能,從而修飾微環(huán)境,導(dǎo)致微環(huán)境中細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性及惡性選擇,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　綜上所述,本課題提出:在腫瘤微環(huán)境中,成纖維

4、細(xì)胞內(nèi)的Caveolin-1蛋白和自噬相關(guān)蛋白相互作用,從而參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。
　　本課題建立成纖維細(xì)胞ESF及乳腺癌細(xì)胞BT474共培養(yǎng)模型,采用siRNA技術(shù)干擾Caveolin-1基因表達(dá),探討成纖維細(xì)胞Caveolin-1與細(xì)胞自噬之間的作用以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響,期望能為乳腺癌的研究提供新的思路。
　　方法
　　1.脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染,qRT-PCR和Westerm Blot

5、方法檢測外源性Caveolin-1特異性干擾RNA(siRNA Caveolin-1)介導(dǎo)成纖維細(xì)胞ESF的Caveolin-1轉(zhuǎn)錄后的基因干擾效應(yīng)。
　　2. Transwell方法建立乳腺癌細(xì)胞BT474和成纖維細(xì)胞ESF共培養(yǎng)模型。
　　3. CCK-8方法檢測ESF細(xì)胞Caveolin-1基因干擾和ESF/BT474共培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)BT474細(xì)胞增殖的影響。
　　4.免疫熒光共聚焦激光顯微鏡觀察 ESF細(xì)胞 Ca

6、veolin-1基因干擾和ESF/BT474共培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)ESF細(xì)胞自噬體的影響,分析Caveolin-1與自噬體之間的關(guān)系。
　　結(jié)果
　　1. qRT-PCR和Western-Bloting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA N.2實(shí)驗(yàn)組 Caveolin-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于其它各實(shí)驗(yàn)組(p<0.05),siRNA N.1組和siRNA N.3組分別與其它各組比較,Caveolin-1 mRNA表達(dá)水平也有顯著差異(p<

7、0.05)。siRNA N.1組、siRNA N.2組和siRNA N.3的 Caveolin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(p<0.05),表明siRNA有效地干擾ESF細(xì)胞表達(dá)Caveolin-1。綜合qRT-PCR結(jié)果和Western blot結(jié)果,選擇siRNA N.2實(shí)驗(yàn)組用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,48小時(shí)、72小時(shí)培養(yǎng)后,與各組比較, BT474/ESF+siRNA N.2共培養(yǎng)組BT474細(xì)胞增殖顯著

8、上調(diào)(p<0.05)。
　　3.免疫熒光共聚焦激光顯微鏡結(jié)果顯示,① BT474/ESF+siRNA N.2共培養(yǎng)組自噬體顯著高于其它各組自噬體(p<0.05),但該組 Caveolin-1表達(dá)則顯著低于其它各組( p<0.05);② ESF單獨(dú)培養(yǎng)組自噬體顯著低于其它組自噬體(p<0.05),但該組 Caveolin-1表達(dá)則顯著高于其它各組(p<0.05);③雖然ESF+siRNA N.2單獨(dú)培養(yǎng)組自噬體和 Caveolin-

9、1表達(dá)與其它各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但遠(yuǎn)不如BT474/ESF+siRNA N.2共培養(yǎng)組自噬體上調(diào)以及Caveolin-1下調(diào)幅度大;④ BT474/ESF共培養(yǎng)組自噬體顯著高于 ESF單獨(dú)培養(yǎng)組和ESF+siRNA N.2單獨(dú)培養(yǎng)組(p<0.05),但顯著低于BT474/ESF+siRNA N.2共培養(yǎng)組( p<0.05), BT474/ESF共培養(yǎng)組 Caveolin-1表達(dá)顯著高于BT474/ESF+siRNA N.2

10、共培養(yǎng)組和ESF+siRNA N.2單獨(dú)培養(yǎng)組,但是低于ESF單獨(dú)培養(yǎng)組(p<0.05)。
　　結(jié)論
　　1.特異性siRNA Caveolin-1可有效發(fā)揮干擾Caveolin-1基因表達(dá)的作用。
　　2.成纖維細(xì)胞 Caveolin-1表達(dá)抑制可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖,乳腺癌細(xì)胞與Caveolin-1表達(dá)抑制的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)可加強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　3.成纖維細(xì)胞Caveolin-1表達(dá)抑制且其自噬體增加,二