Disulfiram聯(lián)合Cu通過上調(diào)ROS-JNK,下調(diào)Nrf2以及NF-κB通路靶向殺傷AML干細(xì)胞.pdf

1、背景：急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一種異質(zhì)性疾病，隨著化療方案的改進(jìn)，其緩解率不斷提高，但難治和復(fù)發(fā)仍然是阻礙AML治愈的主要難題。白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSC)是白血病的起源細(xì)胞，這一小群細(xì)胞能夠自我更新和分化，維持著白血病的發(fā)展，LSC大部分處于靜止期并表達(dá)異常的生存信號通路，這使得它們往往逃逸于主要針對快速增殖細(xì)胞的傳統(tǒng)化療藥物，成為AML難治復(fù)發(fā)的關(guān)

2、鍵，因此，在聯(lián)合化療的基礎(chǔ)上增加針對LSC而又對正常造血細(xì)胞無損傷的靶向藥物才是AML最有效、最根本的治療策略。雙硫侖(disulfiram，DS)是一種在臨床使用了60年的抗酗酒藥物，安全低毒且價(jià)格低廉。近年來研究發(fā)現(xiàn)DS具有廣譜的抗腫瘤活性，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其生長。Cu是生物有機(jī)體一種必需的微量金屬，許多關(guān)鍵的酶和轉(zhuǎn)錄因子需要Cu來發(fā)揮活性。DS具有轉(zhuǎn)運(yùn)Cu離子到胞內(nèi)的能力，添加外源CuCl2可以明顯增強(qiáng)DS殺傷腫瘤細(xì)

3、胞的能力。關(guān)于DS/Cu抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要與其作為蛋白酶體抑制劑抑制NF-κB通路相關(guān)以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。我們研究團(tuán)隊(duì)前期也已經(jīng)證明了DS/Cu能夠通過抑制NF-κB、激活ROS誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病Molt4細(xì)胞和淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，且能逆轉(zhuǎn)急性髓系白血病細(xì)胞HL-60耐藥細(xì)胞株對多柔比星的耐藥。但DS/Cu是否具有殺傷LSC的作用及相關(guān)的機(jī)制仍不明確。核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear fa

4、ctor-κB，NF-κB)是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，是由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。p65/p50二聚體是NF-κB中最重要的一種，廣泛存在于細(xì)胞漿中，可調(diào)控下游一系列抗凋亡基因的表達(dá)，被認(rèn)為是調(diào)控NF-κB活性的關(guān)鍵成分。NF-κB的異常激活跟多種病理現(xiàn)象相關(guān)，它的下游靶基因產(chǎn)物也有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)癌基因蛋白表達(dá)的作用。多種腫瘤細(xì)胞中也觀察到NF-κB的異常激活，同時(shí)一些傳統(tǒng)化療藥物也可以激活NF-κB，使

5、之成為腫瘤耐藥的關(guān)鍵因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在LSC中持續(xù)激活而在正常造血干細(xì)胞中不激活，因此，靶向NF-κB相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅能選擇性殺傷LSC，還能增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物的敏感性?；钚匝?Reactive Oxygen Species，ROS)是體內(nèi)正常氧代謝的產(chǎn)物，生理劑量的ROS可以被體內(nèi)的抗氧化物清除，但急劇增高的ROS可以致使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA過氧化，致使細(xì)胞發(fā)生損傷。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中ROS產(chǎn)生較正常細(xì)胞明顯增多，即處

6、于一種更高的氧化應(yīng)激狀態(tài)，這使得腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞更易受外界氧化刺激的影響，同時(shí)，在持續(xù)的氧化刺激下，一些氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB，Nrf2，c-jun, HIF-1）被激活，調(diào)節(jié)下游的抗氧化蛋白的表達(dá)增加，維持腫瘤細(xì)胞的氧化平衡，這些轉(zhuǎn)錄因子又可通過調(diào)節(jié)下游基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、分化，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步獲得存活優(yōu)勢并產(chǎn)生耐藥性。ROS對于維持LSC生存也有重要作用，小白菊內(nèi)酯及其類似物可以通過抑制NF-κB通路、促進(jìn)

7、ROS蓄積誘導(dǎo)AML和急變期的CML的LSC細(xì)胞凋亡，而對正常的細(xì)胞無影響;最近有人發(fā)現(xiàn)LSC主要存在于ROS低水平(ROS-low)的AML細(xì)胞亞群中，并伴有高表達(dá)的BCL-2，使用BCL-2抑制劑ABT-263可以減弱氧化磷酸化，誘導(dǎo)ROS堆積，最終殺傷這群ROS-low的細(xì)胞，而對正常HSC無明顯影響，提示特殊的氧化還原調(diào)節(jié)機(jī)制也是LSC一個(gè)良好的治療靶點(diǎn)。Nrf2(nuclear factor-erythroid2-relate

8、d factor2)是氧化調(diào)節(jié)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它由ROS誘導(dǎo)激活，而其靶基因產(chǎn)物又可以保護(hù)細(xì)胞從而不受氧化應(yīng)激的損傷。在多種腫瘤細(xì)胞中存在Nrf2的異常激活，同樣也成為引起腫瘤細(xì)胞耐藥的重要因素，近年來發(fā)現(xiàn)，AML細(xì)胞核中存在Nrf2的異常激活，從而保護(hù)AML細(xì)胞免受氧化損傷并產(chǎn)生耐藥性。c-jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)家族是是MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）家族中重要的一員。JNK屬于酪

9、氨酸蛋白激酶途徑，可被不同形式的胞外刺激通過不同的信號通路活化。JNK/c-Jun通路與多種疾病發(fā)生機(jī)制有關(guān)，在AML的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中也有重要作用，多種藥物可通過活化JNK通路引起白血病細(xì)胞的凋亡，而ROS能夠通過抑制JNK磷酸酶及使JNK潛在抑制分子失活等途徑使JNK得到持續(xù)的活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Disulfiram(DS)單藥及DS聯(lián)合Cu離子(DS/Cu)可以通過抑制NF-κB，誘導(dǎo)ROS蓄積而誘導(dǎo)血液系腫

10、瘤細(xì)胞株凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥，因此本研究擬進(jìn)一步探討DS/Cu對LSC的作用及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 目的：以CD34+CD38KG1a細(xì)胞做為LSC模型，并結(jié)合CD34+CD38-原代AML細(xì)胞和正常HSC，探討DS及DS/Cu在體外對LSC的靶向殺傷作用，并進(jìn)一步從NF-κB通路、ROS以及JNK、Nrf2通路探討其潛在的分子機(jī)制。
　　 方法：①應(yīng)用流式細(xì)胞分選術(shù)或磁珠分選術(shù)分選出人急性髓系白血病細(xì)胞株KG1a細(xì)胞和原代

11、AML細(xì)胞中具有LSC特性的CD34+CD38-亞群以及正常人外周動員血或臍血中CD34+細(xì)胞;②利用MTT法檢測濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.25μM的DS及上述濃度的DS/Cu（Cu=1μM）對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的抑制增殖作用及明確DS和DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50);③Annexin-V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測0.05、0.5、5μM的DS、DS/Cu

12、(Cu(=)1μM)以及DS/Cu聯(lián)合ROS抑制劑NAC(10mM)對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用;④應(yīng)用甲基纖維素集落形成實(shí)驗(yàn)檢測濃度分別為0.01、0.1μM DS及DS/Cu(Cu=1μM)對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞集落形成能力的影響;⑤利用DCFA法流式細(xì)胞術(shù)檢測濃度為0.5μM DS及DS/Cu(Cu=1μM)作用6h、12h、18h、24h后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞中ROS水平的變化;⑥利用

13、Western Blot法測1μM Cu、0.5μM DS、0.5μM DS/Cu（Cu=1μM）以及0.5μM DS/Cu聯(lián)合ROS抑制劑NAC(NAC=10mM)作用CD34+CD38-KG1a細(xì)胞24h后細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路、JNK通路、Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;⑦利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測0.5μM DS及0.5μM DS/Cu(Cu=1μM)處理CD34+CD38-KG1a細(xì)胞24h后Nrf2下游通路GSR、NQO1、

14、HO-1基因表達(dá)的變化，采用2-Δct法對PCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，分析上述基因的表達(dá)量與各種不同處理組的關(guān)系;⑧利用Annexin-V、CD34-APC、CD38-PE三標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測0.1、0.5μM的DS和DS/Cu(Cu=1μM)對磁珠分選后的CD34+CD38-原代AML細(xì)胞及HSC的誘導(dǎo)凋亡作用;⑨應(yīng)用甲基纖維素集落形成實(shí)驗(yàn)檢測0.01、0.05、0.1μMDS及DS/Cu對原代AML細(xì)胞及HSC集落形成能力的影響;⑩采用SP

15、SS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多種處理因素作用比較采用析因方差分析;兩組間均數(shù)的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法;多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在方差分析顯著的情況下使用LSD方法（方差齊性）進(jìn)行多重比較;若方差不齊則采用近似F檢驗(yàn)（如Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett T3方法進(jìn)行多重比較;計(jì)量資料用x±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：⑴DS和DS/Cu對CD34+CD38-K

16、G1a細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用。MTT結(jié)果顯示24h的DS和DS/Cu的IC50分別為（0.54±0.18）μM和（0.21±0.028）μM;DS/Cu對CD34+CD38KG1a細(xì)胞的IC50顯著低于DS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.107，P=0.036)，提示Cu可顯著增強(qiáng)DS對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的增殖抑制作用;⑵DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用?？瞻讓φ战M和單Cu組的凋亡率分別為（4.7

17、5±2.6）％、（5.6±4.0）％，DS和DS/Cu不同濃度組的凋亡率分別為[(7.69±3.44)％、(15.06±4.58)％、(32.67±6.06)％]和[(28.83±6.34)％、(42.33±3.21)％、(58.93±1.53)％]。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，1μM單Cu對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞沒有誘導(dǎo)凋亡作用;DS組中，0.05、0.5μM濃度組DS誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡能力與對照組相比無顯著性差異，

18、而5μM濃度組可以顯著誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡;DS/Cu組中，不同濃度的DS/Cu均可以誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡(F=119.069，P=0.000)，且呈劑量依賴性。同一濃度下，DS和DS/Cu誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡比例均顯著高于DS組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-5.078，P=0.007; t=-8.44，P=0.001; t=-7.279，P=0.002)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DS/C

19、u對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞均存在顯著誘導(dǎo)凋亡作用，DS僅在高濃度情況下才能誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞凋亡，DS/Cu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用明顯強(qiáng)于DS。⑶DS及DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的集落形成。0.01、0.1μM的DS及DS/Cu(Cu=1μM)的集落形成單位百分比分別為[(97.19±10.19)％、（69.29±19.54）％]和[(48.55±14.36)％、（0.83±0.72）％]

20、。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析， DS或者DS/Cu均能抑制細(xì)胞集落形成，且隨著濃度增加，CD34+CD38-KG1a的集落形成能力逐漸降低，DS/Cu組降低更加明顯，并表現(xiàn)劑量依賴性。同一濃度下DS和DS/Cu處理CD34+CD38-KG1a細(xì)胞后對細(xì)胞的集落形成能力的影響均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=4.777，P=0.009; t=6.066，P=0.004)。DS和DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞集落形成能力，但DS/Cu抑制集落形成的

21、作用明顯強(qiáng)于DS。⑷DS及DS/Cu能下調(diào)NF-KB通路蛋白表達(dá)。DS單藥可明顯抑制胞核內(nèi)P65蛋白的表達(dá)，而DS/Cu抑制P65蛋白表達(dá)的能力顯著強(qiáng)于DS單藥;同樣，DS單藥和DS/Cu均可抑制NF-κB通路下游c-myc、survivin蛋白的表達(dá)，而DS/Cu的抑制作用明顯強(qiáng)于DS單藥;⑸DS/Cu可誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積。將0.5μM的DS和DS/Cu分別處理CD34+CD38-KG1a細(xì)胞6h、12h

22、、18h、24h后觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。結(jié)果示DS和DS/Cu作用不同時(shí)間后ROS水平分別為[(3180±127.3)％、(2489±345.8)％、(2538±373.0)％、(2569±224.08)％]和[(3431±33.7)％、(7145±488.51)％、(11227±438.6)％、(5853±857.5)％]，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，隨著作用時(shí)間延長，DS處理后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的ROS水平較對照組變化不明顯，而D

23、S/Cu組ROS水平逐漸升高，且在18h達(dá)到頂峰，24h后有一定下降;不同時(shí)間點(diǎn)DS/Cu組ROS生成水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，而DS組ROS水平與對照組間除6h組與對照組有差異外(P=0.000)，其余時(shí)間點(diǎn)與對照組相比無明顯差異(P=0.675; P=0.405; P=0.689)。本結(jié)果顯示DS單藥不能顯著誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，但在Cu離子聯(lián)同作用下可以誘導(dǎo)CD34+CD3

24、8-KG1a細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，且這種蓄積隨著時(shí)間變化，并在18h時(shí)達(dá)到頂峰。⑹DS/Cu可以抑制Nrf2通路。以Western blot方法檢測各處理組作用24h后核內(nèi)Nr￡2蛋白的變化，結(jié)果示DS單藥可以輕度抑制Nrf2表達(dá)，而DS/Cu抑制作用更明顯;實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1，GSR的表達(dá)水平，結(jié)果示DS/Cu均可以顯著抑制HO-1、NQO1、GSR基因mRNA的表達(dá)水平，與對照組相

25、比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000; P=0.009;P=0.001)， DS不能顯著抑制NQO1基因的表達(dá)水平(P=0.243)，但可以顯著抑制HO-1及GSR基因的表達(dá)水平(P=0.009;P=0.001)。本結(jié)果表明DS/Cu可抑制Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1，GSR基因的表達(dá)水平，DS單藥對Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1，GSR基因的表達(dá)水平抑制能力顯著低于DS/Cu。⑺DS/Cu可以激活JNK通路。同樣以Wes

26、tern blot方法檢測作用24h后胞內(nèi)JNK、p-JNK以及p-c-jun蛋白的變化，結(jié)果示JNK無明顯變化，而DS單藥及DS/Cu均能顯著增強(qiáng)p-JNK及p-c-jun的表達(dá)，其中DS/Cu處理組的作用更明顯。⑻ROS是DS/Cu對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用的關(guān)鍵。加入ROS抑制劑NAC后DS/Cu誘導(dǎo)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的凋亡率均出現(xiàn)不同程度下降，0.5μM濃度組從(36.42±2.86)％下降

27、(18.23±6.16)％，5μM濃度組從(53.99±9.34)％下降到（32.22±3.73）％。說明加入抗氧化劑NAC后，DS/Cu的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)削弱了。同樣，利用Western blot比較DS/Cu和DS/Cu/NAC作用后細(xì)胞內(nèi)p-JNK及Nrf2的變化，DS/Cu/NAC組的Nrf2蛋白的表達(dá)明顯弱于DS/Cu組;p-JNK蛋白的表達(dá)上調(diào)作用也明顯弱于DS/Cu組，說明NAC處理可以減弱DS/Cu對p-JNK的激活以及對N

28、rf2的抑制作用，提示DS/Cu可以通過ROS調(diào)控著JNK和Nrf2的表達(dá)。⑼DS/Cu能誘導(dǎo)CD34+CD38-原代AML細(xì)胞凋亡而對HSC(CD34+CD38-)作用較弱。0.1、0.5μM的DS和DS/Cu(Cu=1μM) DS及DS/Cu對CD34+CD38-原代AML細(xì)的凋亡率分別為[(12.50±4.97)％、(17.90±11.89)％]和[（24.83±5.78）％、（62.5±9.82）％]，DS及DS/Cu對HSC的

29、凋亡率為[（9.6±3.68）％、(10.4±3.53)％]和[(24.00±6.17)％、(23.77±10.80)％]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同濃度的DS/Cu均可誘導(dǎo)CD34+CD38-原代AML細(xì)胞凋亡(F=42.834，P=0.000)，0.5μM濃度組也能誘導(dǎo)HSC凋亡(F=4.293，P=0.070)，但DS/Cu對兩種細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力存在顯著差異，對LSC的誘導(dǎo)凋亡作用顯著強(qiáng)于HSC(F=15.395，P=0.002)。不同濃

30、度的DS對CD34+CD38-原代AML細(xì)胞和HSC的誘導(dǎo)凋亡能力均不顯著(P＞0.05)。本結(jié)果顯示DS/Cu可以誘導(dǎo)CD34+CD38-原代AML細(xì)胞凋亡，但只有在高濃度情況下才會誘導(dǎo)HSC凋亡;DS單藥無顯著誘導(dǎo)CD34+CD38-原代AML細(xì)胞和HSC凋亡的能力。⑽低劑量的DS及DS/Cu均能抑制CD34+原代AML細(xì)胞集落形成而不影響HSC集落形成。不同濃度的DS及DS/Cu處理后原代AML細(xì)胞的CFU％分別為[(75.13±

31、13.84)％、(60.24±16.41)％、(20.63±12.08)％]和[（74.95±9.51）％、(44.53±13.31)％、(12.08±13.12)％]，DS及DS/Cu處理后HSC的CFU％為[(103.05±19.00)％、(93.81±7.78)％、(99.89±16.72)％]和[(96.31±20.60)％、(101.59±13.71)％、(92.10±10.23)％]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，不同濃度的DS和DS/Cu均

32、可以抑制原代AML細(xì)胞集落形成(F=35.269，P=0.000，F(xiàn)=16.235，P=0.000)，而該濃度范圍內(nèi)的DS及DS/Cu對正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的集落形成并不存在影響(F=1.141，P=0.299;F=0.441，P=0.726)，說明DS及DS/Cu對兩種細(xì)胞的集落形成的抑制作用不同，對原代AML細(xì)胞的作用顯著強(qiáng)于正常細(xì)胞(F=54.591，P=0.000;F=5.842，P=0.007);本結(jié)果表明DS及DS/Cu均可