NF-κB介導(dǎo)的Rab27A表達上調(diào)促進結(jié)腸癌干細胞的干性.pdf

1、結(jié)腸癌全球高發(fā)，常規(guī)治療后往往發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，治愈率低，致死率世界排名第四。腫瘤干細胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能、無限增殖能力、轉(zhuǎn)移和耐藥特征的數(shù)量極少的細胞群，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的決定性因素。因此深入研究腫瘤干細胞調(diào)控機制有助于設(shè)計針對腫瘤干細胞的治療策略。
　　腫瘤干細胞處在一個由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、炎性細胞和膠質(zhì)細胞等組成的微環(huán)境“niche”中。腫瘤干

2、細胞微環(huán)境介導(dǎo)的基因表達異常是腫瘤演變過程中重要分子事件。微環(huán)境中的炎性因子通過激活腫瘤干細胞相關(guān)通路，如Notch、Hedgehog、STAT3和NF-κB，實現(xiàn)對CSCs的調(diào)控；同時CSCs通過分泌細胞因子對自身所處的“niche”進行改造。研究腫瘤干細胞如何應(yīng)對腫瘤微環(huán)境中的炎癥信號，以及如何通過自分泌和旁分泌的方式對微環(huán)境產(chǎn)生影響是本課題的研究方向。
　　在細胞分泌途徑中Rab蛋白家族發(fā)揮著重要作用。Rab為小GTP酶，屬

3、于Ras超家族，主要負責(zé)細胞內(nèi)囊泡運輸，Rab27是其中主要負責(zé)細胞內(nèi)物質(zhì)分泌的蛋白，有兩個異構(gòu)體 Rab27A和Rab27B。Rab27A功能失常會引發(fā)疾病的發(fā)生，如格里塞利綜合征和代謝綜合癥。在腫瘤研究領(lǐng)域，過表達Rab27A促進乳腺癌和黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移。Rab27A以外泌體依賴和非依賴的方式對腫瘤微環(huán)境進行改造，為腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供條件。本研究旨在回答Rab27A是否影響結(jié)腸癌干細胞的功能？其機制是否與細胞因子分泌有關(guān)？炎癥

4、信號NF-κB是否影響 Rab27A的表達？
　　目的：
　　1)利用結(jié)腸癌臨床樣本，腫瘤細胞系和腫瘤干細胞微球培養(yǎng)模型，檢測Rab27A與腫瘤惡性程度以及腫瘤干細胞干性是否存在相關(guān)性。
　　2)干預(yù)Rab27A是否對HT29腫瘤干細胞干性和增殖有影響?
　　3)在上述功能變化的基礎(chǔ)上，回答Rab27A影響腫瘤干細胞的功能是否與細胞因子分泌有關(guān)。
　　4)最后探討腫瘤干細胞的炎癥微環(huán)境是否參與影響Rab27

5、A在腫瘤干細胞中的表達水平。
　　方法和結(jié)果：
　　1)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌臨床樣本中 Rab27A染色陽性率為66.7％。6株結(jié)腸腫瘤細胞系均能在腫瘤干細胞微球（tumor sphere）培養(yǎng)體系中生長，但是球體形狀不同；流式細胞術(shù)結(jié)果表明，這6株細胞系中干性標(biāo)志分子 CD44+細胞比例與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)性；RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，Rab27A的表達水平與結(jié)腸癌的惡性程度呈正相關(guān)

6、性。
　　2)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示HT29 sphere中干細胞標(biāo)志物CD44+和PKH26high細胞比例明顯高于貼壁腫瘤細胞；RT-PCR結(jié)果顯示，與貼壁HT29細胞比較，腫瘤干細胞標(biāo)志分子在傳代的 sphere中表達升高，而分化標(biāo)志分子表達降低。該結(jié)果表明通過腫瘤干細胞微球培養(yǎng)體系獲得的HT29 sphere具有干性特征。
　　3) RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，在HT29 sphere中Rab27A的

7、表達高于貼壁HT29細胞；過表達Rab27A使HT29 sphere形成數(shù)目和體積增加；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達 Rab27A使 HT29腫瘤細胞中 CD44+和PKH26high細胞比例升高。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示過表達Rab27A使周期相關(guān)蛋白cyclinD和CDK4表達升高，而 p27表達降低；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達Rab27A后HT29腫瘤細胞和sphere細胞中S期細胞比例升高。同時，干涉Rab27

8、A后得到與過表達反向的結(jié)果。
　　4)過表達Rab27A的sphere培養(yǎng)上清促進了HT29 sphere的生長。ELISA結(jié)果顯示，過表達Rab27A的sphere培養(yǎng)上清中VEGF和TGF-β的濃度升高。我們通過激光共聚焦顯微鏡觀察到，Rab27A呈現(xiàn)細胞核周單側(cè)聚集分布，分布密度由細胞核向細胞膜依次遞減；Rab27A表達水平高的細胞群中PKH26high細胞比例增加。該結(jié)果說明Rab27A通過促進細胞因子的分泌影響腫瘤干細胞

9、的功能。
　　5)體內(nèi)功能實驗表明，100個HT29 sphere細胞即可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤。過表達Rab27A后，HT29腫瘤細胞和腫瘤干細胞在裸鼠體內(nèi)生長加快。CD31免疫組化結(jié)果顯示，過表達Rab27A組中血管生成高于對照組，可能與Rab27A促進VEGF分泌有關(guān)。
　　6) RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，HT29 sphere中p65表達高于正常HT29細胞。雙熒光素酶報告實驗顯示，HT29 sp

10、here細胞中NF-κB信號通路活性高于正常HT29細胞。此外，RT-PCR結(jié)果顯示NF-κB下游靶基因IL-6的表達在傳代的HT29 sphere中升高。
　　7) RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過表達p65后Rab27A表達升高，而NF-κB信號通路抑制劑PDTC和BAY-11-7082使Rab27A表達降低。雙熒光素酶報告結(jié)果表明，p65使Rab27A啟動子轉(zhuǎn)錄活性升高，而PDTC和BAY-11-7082使

11、p65介導(dǎo)的 Rab27A啟動子轉(zhuǎn)錄活性降低。
　　8) HT29腫瘤干細胞經(jīng)TNFα處理后，球體生長速度加快；流式結(jié)果顯示CD44+和PKH26high細胞比例升高；雙熒光素酶報告結(jié)果顯示HT29 sphere中NF-κB信號通路活性升高，同時RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示p65和Rab27A的表達升高。
　　結(jié)論：
　　本課題首次確定了Rab27A促進了結(jié)腸癌干細胞的干性和增殖，并促進了結(jié)腸癌腫瘤細