硼替佐米通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)人骨髓瘤細(xì)胞系hCDC14A表達(dá).pdf

1、背景和目的:利用FISH技術(shù)可在約20％～30％初治的多發(fā)性骨髓瘤(MM)中檢測(cè)出1號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶的缺失(1p21)信號(hào),且隨著疾病進(jìn)展,1p21缺發(fā)生率及陽(yáng)性率明顯增高,伴有1p21缺失的患者經(jīng)大劑量化療,生存期無(wú)明顯延長(zhǎng),是獨(dú)立的不良預(yù)后因素。經(jīng)過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選,我們發(fā)現(xiàn)hCDC14A基因參與中心體復(fù)制及細(xì)胞周期的調(diào)控。本課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約40％的患者h(yuǎn)CDC14AmRNA為低表達(dá)(結(jié)果尚未發(fā)表)?；诖?我們推測(cè)hCDC

2、14A有可能參與MM的發(fā)病,本實(shí)驗(yàn)的目的在于進(jìn)一步明確hCDC14A在MM中的作用及對(duì)于MM的一線治療藥物硼替佐米而言,該藥能否參與對(duì)hCDC14A的調(diào)控。
　　 方法:第一部分:采集29例MM患者(24例初治,4例復(fù)發(fā)/難治,1例移植后)骨髓標(biāo)本,Ficoll法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)CD138磁珠分選后,采用RQ-PCR法檢測(cè)hCDC14A與p53基因mRNA的表達(dá)情況,并進(jìn)行相關(guān)性分析。第二部分:1)采用Western-Bl

3、ot法檢測(cè)了我室保存的人骨髓瘤細(xì)胞系(HMCLs)表達(dá)hCDC14A蛋白；2)熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了hCDC14A蛋白在HMCLs中的表達(dá)和定位；3)給予不同濃度的硼替佐米(PS-341)(0、2.6nM、5.2nM、10.4nM)分別處理U266、OPM-2和MM1.S12h和24h,采用RQ-PCR法和Western-Blot法分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)硼替佐米處理前后hCDC14A表達(dá)水平的變化；4)以2.6nM硼替佐米處理O

4、PM-2細(xì)胞0h、3h、6h、9h和12h；以不同濃度硼替佐米(0nM、1.3nM、2.6nM、3.9nM和5.2nM)處理OPM-2細(xì)胞6h,以上藥物分組處理后用Western-Blot法檢測(cè)hCDC14A、P53和磷酸化P53(S315)蛋白表達(dá)的變化；5)為證明硼替佐米對(duì)于hCDC14A的調(diào)控是通過(guò)抑制NF/κB信號(hào)通路而發(fā)揮作用,本實(shí)驗(yàn)用EMSA法檢測(cè)了不同濃度硼替佐米(0nM、2.6nM和10.4nM)作于用OPM-2細(xì)胞6h

5、后,以及2.6nM硼替佐米處理OPM-2細(xì)胞6h和12h后,NF/κB活性的變化。分別用硼替佐米(2.6nM)、MG132(小分子蛋白酶體抑制劑)(500nM)和BAY11—7082(NF/κB通路抑制劑)(5μM)處理U266、OPM-2和MM1.S細(xì)胞12h后觀察hCDC14A的變化;6)為進(jìn)一步明確hCDC14A基因在MM中的作用,構(gòu)建了重組pLKO.1-shRNA-hCDC14A慢病毒載體,進(jìn)行U266細(xì)胞的感染。
　　

6、 結(jié)果:第一部分:對(duì)于所有29例患者而言,hCDC14A和P53 mRNA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.351,P=0.062);為除外因疾病狀態(tài)不同這一混雜因素對(duì)結(jié)果造成影響,僅分析24例初診患者,hCDC14A和p53 mRNA水平仍無(wú)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.291,P=0.167)。第二部分:1)明確了我室保存的HMCLs中RPMI-8226、U266、OPM-2和LP-1為高表達(dá)hCDC14A的細(xì)胞；CZ-1、MM1.RL和M

7、M1.S為低表達(dá)細(xì)胞,以此為基礎(chǔ),此后實(shí)驗(yàn)以U266、OPM-2和MM1.S為主要研究對(duì)象；2)hCDC14A蛋白可廣泛定位于HMCLs的細(xì)胞核及細(xì)胞漿,部分細(xì)胞可見(jiàn)hCDC14A定位于中心體；3)硼替佐米能下調(diào)hCDC14A的表達(dá),且該作用呈時(shí)間-劑量依賴性；4)硼替佐米下調(diào)hCDC14A同時(shí)S315位點(diǎn)磷酸化的P53蛋白表達(dá)水平上調(diào)；5)隨著硼替佐米濃度的遞增,OPM-2細(xì)胞中NF/κB活性的遞減,2.6nM硼替佐米處理OPM-2細(xì)

8、胞6h后NF/κB活性降低,但12h后NF/κB活性較6h時(shí)增強(qiáng),同時(shí)NF/κB通路的抑制劑均可下調(diào)hCDC14A表達(dá),提示硼替佐米是通過(guò)抑制NF/κB活性而對(duì)hCDC14A發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。6)成功包裝了慢病毒pLKO.1-shRNA-hCDC14A并進(jìn)行了U266細(xì)胞的感染,目前正在進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選中。
　　 結(jié)論:hCDC14A的缺失是否為1p21上真正參與MM發(fā)病機(jī)制的分子目前尚缺乏足夠證據(jù),但硼替佐米能通過(guò)抑制NF/