5氮雜胞嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901RUNX3基因表達(dá)的效應(yīng).pdf

1、研究背景與目的：
　　 胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，胃癌發(fā)生的機(jī)制并未完全闡明。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟過程。一般來說，腫瘤的發(fā)生與遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)，DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)修飾。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)DNA甲基化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，一些啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島被甲基化，導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)域所在的基因的表達(dá)沉默，這個(gè)過程是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵步驟。人類的細(xì)胞中,70–80％的CpG 二核苷酸是高甲基化的。然而CpG 島

2、應(yīng)該是非甲基化的，人類有大約60％的基因與CpG 島有關(guān)。正常非甲基化CpG 島的異常甲基化與基因突變、基因缺失的作用一樣，均與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。
　　 胃癌存在許多抑癌基因啟動(dòng)子不同程度的高甲基化。非甲基化的CpG 島在腫瘤細(xì)胞可能轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆腃pG 島，并導(dǎo)致基因功能喪失。RUNX3基因位于染色體1p36.1。
　　 RUNX3基因的表達(dá)產(chǎn)物與Smad 結(jié)合，協(xié)同調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因。人類RUNT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子是TGF-β超

3、家族信號(hào)的重要靶點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族包括3個(gè)成員，分別是RUNX1、RUNX2和RUNX3，它們1個(gè)共同的氨基末端結(jié)構(gòu)域。前兩個(gè)成員分別與人類急性白血病和鎖骨發(fā)育不良等疾病相關(guān)。
　　 RUNX3作為RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有抑癌基因的功能。RUNX3是新型的抑癌基因，RUNX3 在胃癌中常因啟動(dòng)子高甲基化而沉默。近期的研究表明，胃癌細(xì)胞RUNX3表達(dá)由于啟動(dòng)子高甲基化或雜合子缺失而明顯下調(diào)。5-氮雜胞

4、嘧啶（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）是特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可逆轉(zhuǎn)因高甲基化而沉默的基因。本研究應(yīng)用甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP）技術(shù)檢測(cè)5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3 CpG 島的甲基化狀態(tài)的效應(yīng)，應(yīng)用Real-time-RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)其對(duì)RUNX3 mRNA 水平的效應(yīng)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)（flowcytometr

5、y，F(xiàn)CM）檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的效應(yīng)，探討5-Aza-dC是否可逆轉(zhuǎn)RUNX3 CpG島的高甲基化，恢復(fù)RUNX3基因的功能。
　　 研究方法：
　　 1．細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞系SGC-7901 培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中,37℃，50ml/L CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1d 換液1次，每3d 傳代1次。
　　 2．5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3基因啟動(dòng)子

6、CpG 島甲基化狀態(tài)的效應(yīng)：以12μmol/L的5-Aza-dC培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901 72 h，提取基因組DNA，應(yīng)用甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP）技術(shù)檢測(cè)5-Aza-dC對(duì)RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)的效應(yīng)。
　　 3．5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3基因mRNA的效應(yīng)：分別以1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol

7、/L的5-Aza-dC培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901 72 h，提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Real-time-RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901RUNX3 mRNA的效應(yīng)。
　　 4．5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 細(xì)胞周期的效應(yīng)：分別以1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的5-Aza-dC培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901 72 h，收集細(xì)胞，應(yīng)用FCM技術(shù)檢測(cè)

8、5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 細(xì)胞周期的效應(yīng)。
　　 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s x±)表示，應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3基因啟動(dòng)子CpG 島甲基化狀態(tài)的效應(yīng)：
　　 MSP 結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3基因啟動(dòng)子CpG 島為甲基化狀態(tài)；

9、
　　 12μmol/L的5-Aza-dC作用72h后，RUNX3基因啟動(dòng)子CpG 島由甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆癄顟B(tài)。
　　 2.5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3基因mRNA的效應(yīng)：Real-time-RT-PCR 結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞SGC-7901 RUNX3 mRNA 水平較低，5-Aza-dC作用72h后1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L RUNX3的mRNA

10、 相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.05、0.95±0.07、1.22±0.052和1.85±0.03，RUNX3的mRNA 水平以濃度依賴方式增加。RUNX3 mRNA 水平與5-Aza-dC的濃度呈顯著性正相關(guān)（r>0.95，P<0.05）。
　　 3.5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901 細(xì)胞周期的效應(yīng)：FCM 結(jié)果顯示，5-Aza-dC作用72h后，胃癌細(xì)胞SGC-7901 阻滯于G0/G1 期；G0/G1 期細(xì)胞比率