VP3基因對胃癌細胞SGC7901的作用和蛋白質組的研究.pdf

1、目的：構建真核表達載體pEGFP-N1-VP3并穩(wěn)定轉染人胃癌細胞SGC-7901，觀察EGFP-VP3融合蛋白在腫瘤細胞中的分布和亞細胞定位，探討凋亡素誘導腫瘤細胞凋亡的機制。應用雙向凝膠電泳（2-DE）結合質譜技術研究VP3誘導凋亡的SGC-7901細胞（實驗組）與正常培養(yǎng)的SGC-7901細胞（對照組）的差異表達蛋白質。利用蛋白質組學方法探討VP3對胃癌SGC-7901細胞作用的分子機制。 方法：用PCR技術擴增出VP3基

2、因片段，克隆至載體pEGFP-N1，鑒定無誤后，將構建的重組質粒pEGFP-N1-VP3經(jīng)脂質體介導轉染SGC-7901細胞，在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察凋亡素在腫瘤細胞中的分布、亞細胞定位。用AO/EB熒光染色法檢測其在體外誘導腫瘤細胞凋亡的效應。通過雙向凝膠電泳分離VP3處理前后細胞總蛋白，并對IPG膠條（pH3-10，pH4-7）、SDS-PAGE濃度（10％，12％）、電泳時間（6h，7h）進行優(yōu)化，PDQuest圖

3、像分析，MALDI-TOF-MS質譜鑒定，Mascot軟件查詢SWISS-PORT蛋白質數(shù)據(jù)庫，半定量RT-PCR檢測ICEBERGmRNA水平變化，Western blot在蛋白質水平對ICEBERG進行驗證。 結果：經(jīng)限制性內切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實目的基因已插入重組質粒，穩(wěn)定轉染細胞中EGFP-VP3在腫瘤細胞中得以高表達，轉染后逐漸從細胞質遷移至細胞核，最后定位于細胞核內。AO/EB熒光染色觀察到大量細胞凋亡

4、。獲得分辨率高、重復性好的SGC-7901細胞雙向電泳圖譜，對照組樣本的2-DE圖譜檢測到862±36個蛋白點，實驗組樣本檢測到648±27個蛋白點，二者主要蛋白點的位置與數(shù)量基本一致。圖像分析顯示有8個蛋白斑點表達有差異，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測，鑒定了6個可能蛋白，VP3處理后ATP5S、ICBR、TPC6A、TALDO、BAF、RDH13 mRNA和蛋白質表達均下調。 結論：成功構建真核表達載體pEGFP-N1-VP