催產(chǎn)素誘導(dǎo)下ES源性心肌樣細(xì)胞與原代小鼠心肌細(xì)胞的特性比較研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ESC）來源于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹團(tuán)，為具有多分化潛能的細(xì)胞。在特定環(huán)境下，ES細(xì)胞可在體外轉(zhuǎn)化為多種細(xì)胞類型，包括心肌細(xì)胞。在ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中，諸多細(xì)胞因子及藥物對其具有影響作用，如HGF、EGF、bFGF、TGF2β、RA等。這些細(xì)胞因子促進(jìn)了ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并提高了其轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)確性。催產(chǎn)素（oxytocin OT）主要表達(dá)在下丘腦,常被認(rèn)為用于調(diào)節(jié)生殖功

2、能，例如促進(jìn)子宮收縮、乳汁釋放反射、排卵。近來發(fā)現(xiàn)OT/OTR在心臟有表達(dá)。最新的研究表明，在妊娠7天的鼠體內(nèi)催產(chǎn)素受體明顯增高，而這一時期正是心肌細(xì)胞開始轉(zhuǎn)化、形成的時期。并有實驗證明，催產(chǎn)素能夠誘導(dǎo)胚胎性癌細(xì)胞P19向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。由于ES細(xì)胞在體外向心肌細(xì)胞分化與體內(nèi)完整胚胎心肌發(fā)育過程相符，因此，以上均提示催產(chǎn)素在ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)的過程中可能具有協(xié)助作用。國外最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)催產(chǎn)素誘導(dǎo)后的可產(chǎn)生自發(fā)的、有節(jié)律

3、性搏動的細(xì)胞團(tuán)，RA等普通誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞類似，但始終缺乏同原代心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能方面乃至生理特性方面的比較。
　　研究目的：1)研究視黃醇在白血病抑制因子（LIF）維持小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）多潛能性中的協(xié)同作用，2)為催產(chǎn)素誘導(dǎo)下的ES源性心肌樣細(xì)胞與原代小鼠心肌細(xì)胞在生理學(xué)特性及標(biāo)志物表達(dá)上的差異。
　　研究方法：采用小鼠ES細(xì)胞（S6）,第一部分實驗中，通過倒置相差顯微鏡觀察兩組堿性磷酸酶（ALP）染色情

4、況及mESC的形態(tài)變化，通過RT-PCR及Western blot檢測Oct-4和Nanog mRNA及蛋白表達(dá)，并評價兩組ESC未分化狀態(tài)。第二部分實驗將先前未分化狀態(tài)較好的ESC經(jīng)復(fù)蘇，傳代，在體外經(jīng)催產(chǎn)素誘導(dǎo)下向心肌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后第10天，分化細(xì)胞經(jīng)心肌標(biāo)志物α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T（cTnT）、心鈉肽(ANF)的免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色后，倒置顯微鏡及光鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)和染色結(jié)果；通

5、過Western-bolt方法分析心肌特異性蛋白的表達(dá)情況；在電鏡下觀察分化細(xì)胞及小鼠原代心肌細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu)，比較分化細(xì)胞與原代小鼠各項指標(biāo)的差異；通過添加去甲腎上腺素和乙酰膽堿觀察ES源性心肌細(xì)胞的正性和負(fù)性變時效應(yīng)。
　　研究結(jié)果：1.第一部分實驗中，兩組14d后，實驗組大部分細(xì)胞集落形態(tài)維持較好，立體感強(qiáng)；ALP染色強(qiáng)陽性；對照組中僅有35％ESC處于未分化狀態(tài)，ALP染色弱陽性；實驗組未分化細(xì)胞數(shù)量（7.02±0.34）

6、明顯高于對照組（4.28±0.37,P<0.05）。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示：實驗組Nanog及Oct-4mRNA表達(dá)（分別為204.95±11.24,160.69±11.52）均高于對照組（分別為122.89±9.25,88.21±4.69,P<0.05）；實驗組Nanog及Oct-4蛋白的表達(dá)（分別為238.14±14.72、187.16±9.02）均明顯高于對照組（分別為205.04±10.03,132.41

7、±15.78,P<0.05）。2.第二部分實驗中，催產(chǎn)素誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞源性心肌樣細(xì)胞和小鼠原代心肌細(xì)胞cTnT免疫細(xì)胞組織染色陽性，陽性率為分別54.8％和61.2％，實驗組心鈉素、肌鈣蛋白T、α-橫紋肌肌動蛋白表達(dá)分別為198.31±2.68169.29±8.55190.13±19.15，原代小鼠心肌相分別為197.97±2.00171.98±8.31189.95±16.24，兩組比較各項均無明顯差異(P>0.05)；電鏡下觀察ES

8、源性心肌樣細(xì)胞可見排列整齊的肌原纖維、肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和Z帶、以及縫隙連接、橋粒連接。添加去甲腎上腺素后，ES源性心肌樣細(xì)胞和原代小鼠心肌細(xì)胞的搏動頻率明顯增加，但兩者之間無明顯差別(27.3±6.41vs26.17±6.15，P>0.5)，反之，添加乙酰膽堿后，兩組細(xì)胞的搏動頻率減慢，兩者間無明顯差別(24.66±7.12vs24.25±5.47，P>0.5)。
　　結(jié)論：1、在維持胚胎干細(xì)胞未分化潛能方面，中等濃度LIF因子作用時添

9、加視黃醇對維持mESC多潛能性有明顯作用，推測這一作用是通過視黃醇刺激Nanog過表達(dá)實現(xiàn)的。2、催產(chǎn)素誘導(dǎo)下ES源性心肌樣細(xì)胞在結(jié)構(gòu)與受體表達(dá)等方面已與原代心肌細(xì)胞非常的接近，該心肌樣細(xì)胞與原代小鼠心肌細(xì)胞相比，在自律性、傳導(dǎo)性與原代心肌細(xì)胞相同。3、ES源性心肌樣細(xì)胞在標(biāo)志物α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)、肌鈣蛋白T（cTnT）、心鈉素(ANF)表達(dá)上與小鼠原代心肌細(xì)胞相比無明顯差異。4、ES源性心肌細(xì)胞