誘導多能干細胞與心肌細胞融合的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　體外構建誘導多能干細胞與原代心肌細胞的融合細胞，初步探討融合細胞體外生物學特性。
　　[方法]
　　1.iPSCs細胞株(IP14D-102)購自中國科學院動物研究所(北京干細胞庫)，iPSCs接種在事先經(jīng)絲裂霉素C處理過的MEF上，培養(yǎng)基為DMEM-H，包含10％FBS、1000 IU/ml LIF、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、0.1mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸。傳代時先將重懸液差異

2、貼壁1小時去除MEF，然后吸取上清液重新接種到新的MEF飼養(yǎng)層上。
　　2.采用0.1％Ⅱ型膠原酶和0.1％胰蛋白酶分次消化乳鼠心肌組織，分離新生小鼠心肌細胞，體外觀察心肌細胞生物學特點，用免疫熒光法鑒定心肌細胞。
　　3.iPSCs與原代心肌細胞通過PEG-4000誘導融合，免疫熒光法鑒定融合細胞中是否同時表達干細胞和心肌細胞特異性蛋白。融合細胞按照標準iPSCs培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并在體外觀察融合細胞生長特點變化情況，以及體外

3、形成擬胚體的能力檢測。
　　4.RT-PCR和免疫熒光法檢測干絀胞、心肌細胞特異性基因及蛋白在融合細胞中的表達情況。染色體核型分析，確定融合細胞是否發(fā)生細胞核的融合及程度，以及融合細胞堿性磷酸酶染色。
　　[結果]
　　1.飼養(yǎng)層細胞呈長梭形狀貼壁生長，iPSCs克隆團在飼養(yǎng)層細胞上呈圓形或者橢圓形島狀，細胞團周圍折光性強，其內的細胞間排列緊密，界限和形態(tài)不易區(qū)分。熒光顯微鏡下可見與光學顯微鏡下相對應的綠色細胞團(Oc

4、t-4-GFP+)。
　　2.心肌細胞呈三角形、多邊形或者扁平不規(guī)則形態(tài)。培養(yǎng)第3d起，心肌細胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，并可見局部呈同步性收縮的心肌細胞，搏動頻率30-50/分鐘。第12天大部分心肌細胞停止搏動，胞漿出現(xiàn)空泡，細胞皺縮、脫落。細胞免疫熒光染色后，胞漿內可見發(fā)紅色熒光的cTnT。
　　3.PEG-4000能夠介導iPSCs與心肌細胞融合，融合后第4天開始出現(xiàn)成集落狀生長的細胞團，整個實驗期間，均未見到心肌細

5、胞樣的融合細胞出現(xiàn)。染色體核型分析顯示，超過65％的融合細胞表現(xiàn)出四倍體或者近似四倍體的核型。
　　4.不同時間點的融合細胞AKP陽性率不完全相同，而融合細胞的AKP陽性率明顯低于同時間點的iPSCs AKP陽性率；P5代以前的融合細胞同時表達干細胞特異性基因(Oct-4、Nanog)和心肌細胞特異性基因(α-MHC、β-MHC)，之后的融合細胞只表達干細胞特異性基因；融合細胞初期Oct-4蛋白與cTnT蛋白均表達陽性，P4代以后