肝臟TCRγδ+CD3+CD4-CD8-T細胞在小鼠病毒性肝炎中的作用及其作用機制.pdf

1、研究背景及目的：
　　病毒性肝炎以肝細胞損傷為主要特征,然而肝細胞損傷的具體機制尚未完全明確。目前大部分學(xué)者認為肝炎病毒本身并不直接造成肝細胞的損傷,而機體抗肝炎病毒的免疫反應(yīng),特別是免疫細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),是造成肝細胞損傷的主要原因。多種免疫細胞亞群,如CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞(NK)、NKT細胞、調(diào)節(jié)性 T細胞、巨噬細胞等,都被證實在這一病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來隨著對肝炎發(fā)病機制研究的深入,越來越多的

2、研究表明非特異性免疫反應(yīng),特別是 NK細胞和巨噬細胞介導(dǎo)的非特異性免疫反應(yīng),也參與了病毒性肝炎感染引起肝臟損傷的發(fā)病機理。我們對 HBV誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭(FHF)和慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)研究后發(fā)現(xiàn),肝臟 NK細胞通過死亡受體途徑 Fas/FasL和NK細胞受體配體識別途徑 NKG2D/NKG2DL對肝細胞造成損傷。在3型鼠肝炎病毒(MH

3、V-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中活化的巨噬細胞能夠分泌炎性因子 TNF, IL-1進一步促進肝臟中的炎癥反應(yīng)并加重肝細胞損傷。此外,活化的巨噬細胞還分泌促凝血活性物質(zhì) fgl2凝血酶原酶(fibrinogen like protein2), fgl2凝血酶原酶可以激活凝血級聯(lián)反應(yīng),引起肝臟微循環(huán)障礙并導(dǎo)致肝細胞大塊死亡。因此明確各種免疫細胞及其分泌的細胞因子形成的免疫網(wǎng)絡(luò)在病毒性肝炎引起肝細胞損傷中的作用將有助于更加全面的認識病毒性肝炎

4、的發(fā)病機制,并為其臨床診斷和治療提供重要的靶點。
　　近年研究發(fā)現(xiàn),機體存在一種新型 T細胞亞群——CD3+CD4-CD8-細胞(雙陰性 T細胞,DN T)。在健康人群和正常小鼠外周血 T細胞中,DNT細胞所占比例為1–5％。隨著對 DN T細胞的深入研究,越來越多的證據(jù)表明 DNT細胞在多種疾病,如移植排斥、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、感染性疾病、過敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病的病理進程中發(fā)揮重要作用。在不同的疾病中DN T細

5、胞表達不同的表面標志細胞,分泌獨特的效應(yīng)因子,通過這些效應(yīng)因子發(fā)揮其生物學(xué)功能。在器官移植模型中,將脾細胞來源的DN T細胞克隆后輸入小鼠體內(nèi),DN T細胞能夠通過 Fas/Fasl、穿孔素等途徑殺傷抗供者 CD4+T細胞、CD8+T細胞和B細胞,從而提高移植物的存活時間和存活率。Zhang, Z等通過對 MRL/lpr小鼠模型中DNT細胞研究后發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠(MRL/lpr)中DNT細胞高表達 IL-17和IL-23R,并

6、且與疾病進程及嚴重程度呈正相關(guān)。在感染土拉熱弗郎西絲菌(Francisella tularensis)的小鼠中,研究發(fā)現(xiàn)感染后肺組織中DN T細胞可以分化為兩個亞群,一群主要分泌 IL-17,而另一群以分泌 IFN-γ為主,并在疾病進程中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。Lis R.V等研究發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲感染者外周血 TCRαβ+DNT(TCRαβ+CD4-CD8-)細胞可以分泌炎性細胞因子IFN-γ和TNF-α,而TCRγδ+DNT(TCRγδ+

7、CD4-CD8-)主要分泌調(diào)節(jié)性細胞因子 IL-10。
　　迄今,肝臟 DN T細胞是否在病毒性肝炎中發(fā)揮作用尚不明確。本實驗室以鼠3型肝炎病毒(MHV-3,murine hepatitis virus3)感染 C3H/Hej小鼠成功建立了小鼠病毒性肝炎模型,本研究擬利用MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型,探討 DN T細胞在病毒性肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用。具體研究目標如下:
　　1.研究在病毒性肝炎模型小鼠肝臟中DN T細胞

8、TCRγδ+ DN T細胞亞群和TCRαβ+DN T細胞亞群的比例。在疾病進程中動態(tài)觀察病毒性肝炎模型小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細胞比例、數(shù)量。
　　2.鑒定肝臟 TCRγδ+ DN T細胞的表面標志和細胞因子譜。
　　3.探討肝臟 TCRγδ+ DN T細胞細胞對肝細胞的損傷作用及機制。
　　研究方法：
　　1.MHV-3腹腔感染途徑建立小鼠病毒性肝炎模型。流式細胞術(shù)檢測正常和感染MHV-310天后模型小鼠

9、肝臟 DNT表達 TCRγδ+和TCRαβ+的比例。動態(tài)觀察MHV-3感染0、3、7、10、15、20、30天后模型小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細胞在肝臟 T細胞中比例變化及其絕對計數(shù)。
　　2.流式細胞術(shù)檢測感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細胞表達表面標志 CD30、 CD25、CD28和CD44的百分率、感染 MHV-3后各時間點肝臟TCRγδ+DN T細胞表達活化標志 CD69分子的百分

10、率。采用細胞因子染色法檢測肝臟 TCRγδ+DN T細胞分泌 IL-2、 IL-4、 IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,tumor necrosis factor-α)、γ-干擾素(interferon,IFN-γ)、穿孔素(perforin)和顆粒酶 B(granzyme B)的水平。采用α-GalCer:mCD1d二聚體來鑒定肝臟 TCRγδ+DN T細胞與 NKT細胞之間的關(guān)系。

11、>　　3.體外實驗:磁珠分選肝臟 TCRγδ+DN T細胞。膠原酶原位灌流消化法分離小鼠原代肝細胞。以感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細胞為效應(yīng)細胞,肝細胞為靶細胞,采用非放射性細胞毒實驗檢測肝臟 TCRγδ+DN T細胞在體外對正?；蚋腥?MHV-3的原代肝細胞的殺傷活性。采用Transwell法檢測肝臟 TCRγδ+DN T細胞對肝臟細胞的殺傷作用是否依賴細胞與細胞間的接觸。在體外,通過抗體阻斷

12、TNF-α, IFN-γ和IL-17A檢測肝臟 TCRγδ+ DN T細胞殺傷肝細胞的作用途徑。
　　4.體內(nèi)實驗:將磁珠分選純化的肝臟 TCRγδ+ DN T細胞經(jīng)尾靜脈被動轉(zhuǎn)移過繼到MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠體內(nèi)(3×106/只),同體積 PBS液尾靜脈轉(zhuǎn)移過繼到 MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠體內(nèi)作為對照,觀察兩組生存曲線、轉(zhuǎn)移過繼3天后各組外周血 AST和ALT水平、肝臟組織 H-E染色。
　

13、　結(jié)果：
　　1.在正常小鼠和MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型中,肝臟DN T細胞以TCRγδ+ DN T細胞亞群為主。在感染 MHV-3后各時間點肝臟 TCRγδ+DN T在肝臟 T淋巴細胞中的比例較感染前顯著升高,在感染后10天達到最高值(19.7±3.22％);肝臟TCRγδ+DN T細胞數(shù)量在 MHV-3感染后顯著增加,在感染后10天達到最高峰(6.51±1.29×105)。
　　2.流式細胞術(shù)檢測 MHV-3誘導(dǎo)

14、的小鼠病毒性肝炎模型中肝臟 TCRγδ+DN T細胞的表面標志為 TCRγδ+ CD3+ CD4- CD8- CD25- CD28- CD30- CD44+。肝臟 TCRγδ+DNT細胞不能特異性識別α-半乳糖酰基鞘氨醇,表明這群細胞不屬于 NKT細胞亞群。在感染 MHV-3后,隨著病程進展,肝臟 TCRγδ+DNT表面活化標志 CD69分子表達水平持續(xù)升高,在感染后10天達到最高水平(83.45±5.32％)。模型中肝臟TCRγδ+D

15、N T表達 TNF-α、INF-γ、IL-17A和IL-2,幾乎不表達 IL-4、IL-10、IL-21、IL-22、FasL、穿孔素(perforin)和顆粒酶 B(granzyme B)。
　　3.體外實驗:MHV-3誘導(dǎo)的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝臟 TCRγδ+DN T細胞對染后肝細胞有明顯的殺傷作用。通過 Transwell實驗發(fā)現(xiàn),肝臟 TCRγδ+ DN T細胞對感染后肝細胞的直接殺傷作用不需要細胞與細胞間的接觸

16、。通過抗體阻斷試驗證明,阻斷 TNF-a后肝臟 TCRγδ+DN T細胞對感染后肝細胞的殺傷作用顯著降低,而單獨阻斷 IFN-γ或 IL-17A后肝臟 TCRγδ+DNT細胞對感染后肝細胞的殺傷作用無顯著改變。
　　4.體內(nèi)實驗:將感染 MHV-310天后小鼠病毒性肝炎模型中肝臟 TCRγδ+DNT細胞過繼給感染 MHV-35天后小鼠病毒性肝炎模型小鼠,小鼠生存率顯著降低,從41.7％下降至8.33％。在過繼3天后,肝臟 TCRγ

17、δ+ DN T細胞轉(zhuǎn)移過繼組小鼠血清 ALT和AST水平較 PBS過繼對照組顯著升高;在過繼3天后,肝臟 TCRγδ+ DN T細胞轉(zhuǎn)移過繼組肝臟病理損傷較 PBS過繼對照組更加明顯,出現(xiàn)肝細胞水腫、氣球樣變、點狀壞死、灶狀壞死,甚至碎片狀壞死,并伴有大量淋巴細胞浸潤。
　　結(jié)論：
　　1.本研究首次利用MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型探討了肝臟 TCRγδ+ DN T細胞在病毒性肝炎中的作用。研究發(fā)現(xiàn)小鼠病毒性肝炎模型中

18、肝臟 TCRγδ+DNT細胞具有獨特的表面標志。這群細胞不屬于 NKT細胞亞群。在感染 MHV-3后,肝臟TCRγδ+DNT細胞的數(shù)量大量增加并且大量活化,表達細胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-2。
　　2.MHV-3誘導(dǎo)的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝臟 TCRγδ+DNT細胞對感染后肝細胞有顯著的殺傷作用。這種殺傷作用不依賴細胞和細胞間的接觸。通過抗體阻斷實驗證明肝臟 TCRγδ+DNT細胞主要是通過 TN