CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在α-干擾素治療小鼠肝纖維化中的作用.pdf

1、α-干擾素(Interferon-alpha，IFN-α)是由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和病毒感染的組織細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的一類具有多種生物活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 肝纖維化（Hepatic fibrosis）是繼發(fā)于肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過(guò)程中的代償性反應(yīng)，是一切慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，也是向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，其實(shí)質(zhì)是組織發(fā)生修復(fù)反應(yīng)時(shí)ECM合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過(guò)程，肝纖維化最終可發(fā)展

2、為肝硬化甚至肝癌。肝臟是一個(gè)免疫器官，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子均參與肝臟炎癥及肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。
　　 四氯化碳(CCl4)致使小鼠肝纖維化為探討IFN-α抗小鼠肝纖維化免疫應(yīng)答機(jī)制提供了一個(gè)寶貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在CCL4導(dǎo)致的肝臟慢性炎癥階段，炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)循環(huán)交替、HSC持續(xù)激活、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與分解代謝失衡，過(guò)度沉積于肝臟，導(dǎo)致肝纖維化。用藥物總體調(diào)節(jié)肝臟的免

3、疫微環(huán)境，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功能方向發(fā)展，可能成為治療肝纖維化的一種新思路，對(duì)闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制及探索肝纖維化治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 我們利用成功建立的小鼠肝纖維化模型，動(dòng)態(tài)觀察IFN-α不同劑量組在不同治療周期對(duì)小鼠模型肝臟的影響，以及免疫效應(yīng)細(xì)胞的變化，探討α-干擾素治療肝纖維化的最佳劑量及機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中

4、國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證編號(hào):SCXK京200420001);四氯化碳(CC14):分析純，上海長(zhǎng)江化工廠;橄欖油:山東魯花集團(tuán)產(chǎn)品;注射用重組人IFN-α2b:購(gòu)自美國(guó)先靈葆雅，批號(hào):010L30201;兔抗小鼠I型膠原多克隆抗體，購(gòu)自ABCAM公司;流式單克隆抗體:購(gòu)自美國(guó)BD公司。
　　 2、動(dòng)物模型制作、分組及相應(yīng)處理
　　 (1)除10只正常組小鼠外，每只腹腔注射10％ CC14（橄欖油稀釋）5u

5、l/g，3次/周，共8周（前兩次注射劑量減半）。
　　 (2)正常對(duì)照組(n=10):不予處理;生理鹽水對(duì)照組(n=9):0.9％生理鹽水100ul/只皮下注射，隔日一次;低劑量IFN-α治療組(n=8)，400U/只皮下注射:中劑量IFN-α治療組(n=8)，800U/只皮下注射;高劑量IFN-α治療組(n=9)，1200U/只，皮下注射，隔日一次（前三次劑量減半）。在治療3周和六周時(shí)，做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　 注明:臨床上

6、針對(duì)病人的治療劑量:100萬(wàn)/50kg、200萬(wàn)/50kg、300萬(wàn)/50kg，換算成小鼠按每只20g計(jì)算，從而得出低劑量組、中劑量組和高劑量組。
　　 3、病理檢查
　　 殺鼠取其肝臟，在肝左葉組織同部位取2塊，每塊組織約1cm×1cm×0.5cm大小，立即放入10％甲醛溶液中固定保存，備檢。切片做病理HE染色、MASSON染色以及Ⅰ型膠原染色。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肝臟及脾臟細(xì)胞
　　 FAC

7、S檢測(cè)CD8+T細(xì)胞、活化T細(xì)胞、Tregs。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，不同組之間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA分析)，同質(zhì)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量與肝纖維化評(píng)分的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、IFN-α對(duì)肝纖維化小鼠肝組織病理的影響
　　 造模成功與否判斷:

8、造模6周及8周后分別取2只鼠，取肝臟做病理HE染色驗(yàn)證其肝纖維化模型是否成功。匯管區(qū)周圍纖維化明顯，有芒狀纖維和纖維間隔形成。中度肝纖維化形成即可。（纖維隔形成并互相連接深入小葉內(nèi)，小葉結(jié)構(gòu)保留或紊亂，但無(wú)肝硬化。）
　　 與生理鹽水組相比，IFN-α高、中及低劑量治療組肝組織纖維化程度好轉(zhuǎn)，尤其是中劑量治療組療效在治療六周時(shí)最為顯著。
　　 2、I型膠原免疫組化染色結(jié)果
　　 正常對(duì)照組小鼠肝臟Ⅰ型膠原主要表達(dá)

9、在匯管區(qū)，以及肝竇周圍，其他肝臟實(shí)質(zhì)區(qū)域基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá);生理鹽水對(duì)照組，膠原布滿視野，膠原交連呈網(wǎng)狀，破壞了正常肝小葉結(jié)構(gòu);中劑量IFN-α治療后肝組織膠原沉積有明顯減少，陽(yáng)性表達(dá)基本恢復(fù)正常。Ⅰ型膠原的光密度值，中劑量治療組和生理鹽水組有顯著的差異。
　　 3、IFN-α對(duì)肝纖維化小鼠治療過(guò)程中免疫細(xì)胞的變化
　　 中劑量IFN-α治療后，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組有顯著的降低，而CD4+CD25+Foxp3