Smad4在調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)和記憶中的作用.pdf

1、背景：CD8+T細(xì)胞在清除胞內(nèi)感染的病原時(shí)發(fā)揮重要作用，基于T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫進(jìn)行免疫接種，逐漸受到免疫學(xué)家們的關(guān)注。然而，目前我們對(duì)于CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與記憶分化的調(diào)節(jié)機(jī)制還知之甚少。
　　機(jī)體感染病毒或胞內(nèi)菌時(shí)，T細(xì)胞反應(yīng)會(huì)經(jīng)歷三個(gè)特征明顯的階段：克隆擴(kuò)增期，T細(xì)胞收縮期和記憶細(xì)胞形成期?？乖禺愋猿跏糃D8+T細(xì)胞在接觸相應(yīng)抗原后活化擴(kuò)增為效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，同時(shí)會(huì)分化為具有不同功能和表型的細(xì)胞亞群，主要有以 KLR

2、G1hiCD127low為標(biāo)記的短時(shí)效應(yīng)細(xì)胞和以 KLRG1lowCD127hi為標(biāo)記的記憶前體效應(yīng)細(xì)胞。短時(shí)效應(yīng)細(xì)胞為終末分化的細(xì)胞，在感染清除后死亡。記憶前體效應(yīng)細(xì)胞中的一部分可以存活下來(lái)成為記憶性T細(xì)胞，其中中心記憶性T細(xì)胞可以在體內(nèi)維持穩(wěn)定的自我更新。機(jī)體再次感染相同抗原時(shí)，中心記憶性T細(xì)胞可以快速擴(kuò)增、分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞，迅速清除病原。
　　CD8+T細(xì)胞活化為效應(yīng)細(xì)胞、分化產(chǎn)生記憶細(xì)胞的過(guò)程中受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)

3、。轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes、Bcl6、Blimp1和Tcf1在CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與記憶中的作用已有報(bào)道。Best JA等對(duì)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞及記憶T細(xì)胞，進(jìn)行了基因表達(dá)譜的高通量分析，發(fā)現(xiàn)更多 CD8+T細(xì)胞活化與分化中可能涉及的轉(zhuǎn)錄因子。其中，TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子Smad4，可能參與CD8+T細(xì)胞的活化與分化。Smad4在T細(xì)胞中的具體作用及機(jī)制還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本研究使用T細(xì)胞中特異性敲除Smad4的Sm

4、ad4fl/fl;Lck-Cre（Smad4-/-）小鼠及對(duì)照小鼠（Smad4fl/fl），以尾靜脈注射 OVA修飾的李斯特菌（LM-OVA）為感染工具，用以活化抗原特異性Kb-ova+CD8+T細(xì)胞，探究Smad4在CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與記憶中的作用。LM-OVA在小鼠中的主要感染部位是小鼠脾、其次是小鼠肝。
　　目的：探究Smad4在CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與記憶中的作用，并揭示Smad4缺失造成CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與分化異常的機(jī)制。<

5、br>　　方法和結(jié)果：
　　1）通過(guò)檢測(cè)初次感染LM-OVA7d時(shí)小鼠脾Kb-ova+CD8+T中CD44、CD43、CD62L、CD27等分子的表達(dá)，探究Smad4缺失對(duì)CD8+T細(xì)胞活化的影響。通過(guò)檢測(cè)初次感染LM-OVA7d時(shí)小鼠脾中Kb-ova+CD8+T的比例、數(shù)量和增殖情況，探究Smad4缺失對(duì)CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的活化、增殖情況與對(duì)照小鼠相比，沒(méi)有明顯差異。<

6、br>　　2）通過(guò)檢測(cè)初次感染35d時(shí)，小鼠脾中Kb-ova+CD8+T的比例、數(shù)量，探究Smad4缺失對(duì)記憶性 CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示 Smad4缺失小鼠中記憶CD8+T細(xì)胞的比例和數(shù)量與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異。
　　3）通過(guò)檢測(cè)再次感染5d時(shí)，小鼠脾Kb-ova+CD8+T中CD44、CD43、CD62L、CD27等分子的表達(dá)及Kb-ova+CD8+T比例和數(shù)量，探究Smad4缺失對(duì)記憶性CD8+T細(xì)胞活化與擴(kuò)增的影

7、響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠中記憶CD8+T細(xì)胞的活化和克隆擴(kuò)增與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異。
　　4）Granzyme B、IFN-γ、TNF-α是效應(yīng)CD8+T細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的重要效應(yīng)分子。通過(guò)檢測(cè)初次感染7d和再次感染5d時(shí)，小鼠脾Kb-ova+ CD8+T細(xì)胞中Granzyme B、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)比例和平均熒光強(qiáng)度，探究 Smad4缺失對(duì)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)分子產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠脾中產(chǎn)生Gra

8、nzyme B的Kb-OVA+CD8+T細(xì)胞比例與對(duì)照相比明顯減少，而產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的細(xì)胞比例與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異。Granzyme B、IFN-γ、TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照相比均沒(méi)有明顯差異。通過(guò)將效應(yīng)CD8+T細(xì)胞與OVA修飾的El4細(xì)胞共孵育，進(jìn)行效應(yīng)CD8+T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)，探究Smad4缺失對(duì)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞體外殺傷活性的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失后效應(yīng)CD8+T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用減弱。通

9、過(guò)肝臟載菌量實(shí)驗(yàn)，探究Smad4缺失對(duì)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞清除胞內(nèi)病原能力的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠肝臟載菌量較對(duì)照相比明顯增加。這些結(jié)果表明Smad4缺失導(dǎo)致效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的殺傷活性減弱。
　　5）通過(guò)檢測(cè)初次感染7d和再次感染5d時(shí)，小鼠脾Kb-ova+CD8+T中KLRG1、CD127的表達(dá)，探究Smad4缺失對(duì)CD8+T分化的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠抗原特異性 CD8+T細(xì)胞中的KLRG1hiCD127l

10、ow的比例較對(duì)照相比明顯減少，而KLRG1lowCD127hi的細(xì)胞比例顯著增加，即短時(shí)效應(yīng)細(xì)胞（SLECs）比例減少，記憶前體效應(yīng)細(xì)胞（MPECs）比例增加。通過(guò)檢測(cè)初次感染7d，小鼠脾Kb-ova+ CD8+T中效應(yīng)與記憶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的mRNA和蛋白表達(dá)，探究Smad4缺失是否影響效應(yīng)與記憶相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果顯示Smad4缺失導(dǎo)致效應(yīng)相關(guān)分子T-bet、Blimp1表達(dá)減少，而記憶相關(guān)分子Tcf1、Bcl6、Eomes表達(dá)增加。<

11、br>　　6）Smad4-/-小鼠中CD4+、CD8+T細(xì)胞中都缺失Smad4表達(dá)，而CD4+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞的活化和記憶中具有輔助作用。通過(guò)對(duì)Th和Treg細(xì)胞比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Smad4-/-小鼠與對(duì)照小鼠脾中Th1、Th2、Th17和Treg的表達(dá)沒(méi)有差異。但由于CD8+T細(xì)胞還可能受炎性細(xì)胞因子或其他因素的影響，為進(jìn)一步探究Smad4缺失導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與記憶異常，是CD8+T細(xì)胞內(nèi)源性的缺陷，還是外界因素引起，進(jìn)

12、行CD8+T細(xì)胞體外活化實(shí)驗(yàn)和骨髓嵌合體小鼠競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞體外活化時(shí)，Smad4缺失對(duì)CD8+T細(xì)胞的活化沒(méi)有影響，表達(dá)Granzyme B的細(xì)胞比例減少。在骨髓嵌合體小鼠中，Smad4缺失導(dǎo)致產(chǎn)生Granzyme B的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞比例減少、記憶前體效應(yīng)細(xì)胞增加、短時(shí)效應(yīng)細(xì)胞減少等現(xiàn)象依然存在。此外在骨髓嵌合體小鼠中，初次感染后35d Smad4-/-小鼠來(lái)源的Kb-ova+CD8+T細(xì)胞比例明顯低于來(lái)源于對(duì)照小

13、鼠的Kb-ova+CD8+T細(xì)胞。Smad4缺失導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞效應(yīng)與分化異常為CD8+T細(xì)胞內(nèi)源性缺陷，并提示Smad4缺失導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞具有內(nèi)源性的記憶缺陷。
　　7）通過(guò)檢測(cè)初次感染35d時(shí)，小鼠脾Kb-ova+CD8+T細(xì)胞中CD62L和CD27的表達(dá)，探究Smad4缺失對(duì)中心記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示Smad4缺失小鼠記憶CD8+T細(xì)胞中，CD62Lhi中心記憶型CD8+T細(xì)胞比例較對(duì)照相比明顯減少

14、，但CD27hi中心記憶型CD8+T細(xì)胞比例沒(méi)有明顯異常。進(jìn)一步檢測(cè)初次感染后10d、21d時(shí)Kb-OVA+CD8+記憶前體效應(yīng)細(xì)胞中CD62Lhi細(xì)胞比例，探究Smad4缺失導(dǎo)致的中心記憶性CD8+T細(xì)胞減少?gòu)暮螘r(shí)開(kāi)始發(fā)生。結(jié)果顯示初次感染10d時(shí)， Smad4缺失小鼠中心記憶性CD8+T細(xì)胞比例與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異，但感染21d時(shí)，Smad4缺失小鼠中心記憶性CD8+T細(xì)胞比例與對(duì)照相比已明顯減少。通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠脾中記憶前

15、體效應(yīng)細(xì)胞的增殖和凋亡，探究Smad4缺失對(duì)記憶性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生與存活的影響。結(jié)果表明Smad4缺失后記憶性CD8+T細(xì)胞的增殖沒(méi)有缺陷，但Smad4缺失導(dǎo)致記憶前體效應(yīng)細(xì)胞的凋亡增加，記憶細(xì)胞存在存活缺陷。
　　結(jié)論：Smad4缺失不影響CD8+T細(xì)胞的活化和克隆擴(kuò)增，但Smad4缺失會(huì)導(dǎo)致分泌殺傷效應(yīng)因子Granzyme B的抗原特異性CD8+T細(xì)胞比例減少，體內(nèi)外殺傷效應(yīng)減弱，Smad4具有促進(jìn)效應(yīng) CD8+T細(xì)胞發(fā)揮殺