LXRα通過(guò)下調(diào)IRF3-GRIP1抑制LPS誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞活化.pdf

1、目的：核受體肝X受體(LXR)α是在肝臟以及巨噬細(xì)胞中呈高表達(dá)的核受體，它作為諸多基因的轉(zhuǎn)錄因子在機(jī)體發(fā)揮著重要作用。許多實(shí)驗(yàn)表明LXRα作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)，除了誘導(dǎo)許多參與膽固醇逆轉(zhuǎn)動(dòng)、肝糖原代謝以及脂肪酸合成的基因外，另外LXRα還抑制了一系列由細(xì)菌感染、LPS、TNF-α或IL-β等因子誘導(dǎo)的炎癥基因。但LXRα負(fù)性調(diào)控炎性基因的表達(dá)的具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察LXRα激動(dòng)劑對(duì)LPS刺激后Kupffer細(xì)胞IRF3、GRI

2、P1、LXRα及炎癥因子IFNβ表達(dá)的影響，探討LXRα抑制LPS誘導(dǎo)的Kupffer細(xì)胞(KCs)激活效應(yīng)的可能機(jī)制。 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合選擇性貼壁法分離雄性KM小鼠肝臟中的Kupffer細(xì)胞，分離出的Kupffer細(xì)胞用含20％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液24h后隨機(jī)分為四組：(1)正常對(duì)照組：以RPMI1640完全培養(yǎng)液置孵箱培養(yǎng)30h； (2)LPS處理組：倒掉原培養(yǎng)液，以RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h

3、后，再用含1μg/ml LPS的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)6h；(3)T0901317組：倒掉原培養(yǎng)液，用含5μg/ml T0901317的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再以RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)6h； (4)LPS+T0901317組：倒掉原培養(yǎng)液，以含5μg/ml TO901317的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，再改為含1μg/ml LPS的RPMI1640完全培養(yǎng)液，置孵箱培養(yǎng)6h。收集培養(yǎng)上清液及細(xì)

4、胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)(SABC法)及Western blot法檢測(cè)Kupffer細(xì)胞的LXRα、GRIPl及IRF3蛋白表達(dá)水平；SYBR Green I嵌合熒光法Real-Time PCR測(cè)定LXRα、GRIP1及IRF3mRNA表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFNβ含量。 結(jié)果：(1)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：LXRα、IRF3及GRIP1陽(yáng)性表達(dá)均位于核內(nèi)，陽(yáng)性被染成棕色。IRF3蛋白在L

5、PS處理組染色最深，聯(lián)合處理組次之，在正常對(duì)照組及LXR激動(dòng)劑幾乎未著色；GRIP1的染色情況與IRF3大致相同；LXRα陽(yáng)性染色在LXRa激動(dòng)劑組表達(dá)最高，在聯(lián)合處理組明顯降低，在LPS處理組最低。(2)以各指標(biāo)的log cDNA/log β-actin比值的x±s表示各指標(biāo)mRNA平均表達(dá)水平。在LPS組中IRF3及GRIP1mRNA表達(dá)量最高(分別為1.089±0.0074、0.8922±0.0095)，聯(lián)合處理組中其表達(dá)明顯降低

6、(分別為0.7234±0.0072、0.6905±0.0042)，兩組間均數(shù)差異均有顯著意義(P＜0.05)；在LPS組及聯(lián)合處理組中，IRF3及GRIP1 mRNA水平均高于對(duì)照組(分別為0.3558±0.0051、0.3842±0.0083)及LXRα激動(dòng)劑組(分別為0.333±0.0054、0.2778±0.0091)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LXRα在LPS組中(0.2722±0.0038)的表達(dá)明顯低于其它三組(對(duì)

7、照組：0.3953±0.0051，聯(lián)合處理組：0.7963±0.0075，LXRa激動(dòng)劑組：0.9912±0.0098)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LXRα在LXRα激動(dòng)劑組的表達(dá)最高，與其它三組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；聯(lián)合處理組中，LXRα表達(dá)明顯低于LXRα激動(dòng)劑組(P＜0.05)，但又顯著高于其它兩組(P＜0.05)。(3)Western blot結(jié)果：用內(nèi)參照對(duì)待測(cè)物灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。IRF3及GRIPl

8、蛋白表達(dá)量在LPS組最高(分別為0.388±0.018，0.276±0.015)，聯(lián)合處理組表達(dá)明顯降低(分別為0.318±0.014，0.224±0.017)，兩組間均數(shù)差異均有顯著意義(P＜0.05)；在LPS組及聯(lián)合處理組中，IRF3及GRIPl蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組(分別為0.268±0.025、0.1 624±0.013)及LXRα激動(dòng)劑組(分別為0.213±0.017、0.133±0.013)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、5)；LPS組LXRα表達(dá)最低(其值為0.534±0.014)，明顯低于其它三組(對(duì)照組：1.034±0.024，聯(lián)合處理組：1.224±0.027，LXRα激動(dòng)劑組：1.744±0.034) ，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LXRα在LXRα激動(dòng)劑組的表達(dá)最高，與其它三組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；聯(lián)合處理組中，LXRα表達(dá)明顯低于LXRα激動(dòng)劑組(P＜0.05)，但又顯著高于其它兩組(P＜0.05)。(4)ELISA結(jié)

10、果表明：IFNβ在LPS處理組的含量(329.54±35)顯著高于對(duì)照組(129.6±17)及LXRα激動(dòng)劑組(112.8±24)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)；聯(lián)合處理組IFNl3含量(224.4±33)比LPS處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)：IrNβ表達(dá)LXRα激動(dòng)劑組表達(dá)最低。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在應(yīng)用LPS處理之前預(yù)防性應(yīng)用LXRα激動(dòng)劑，能明顯抑制Kupffer細(xì)胞的IRF3及GRIP1表達(dá)