Sohlh2通過下調(diào)HIF1α抑制缺氧誘導上皮性卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景:在所有婦科相關腫瘤類型引起的致死病因中，卵巢癌位于第一位。正常卵巢位于女性盆腔深處，臨床上早期篩查手段效率低，卵巢癌患者確診腫瘤時，多數(shù)已處于臨床晚期，故5年存活率常低于30％。上皮性卵巢癌作為卵巢癌中最常見的一種類型，多在臨床發(fā)現(xiàn)時，已浸潤轉(zhuǎn)移至盆腔或腹腔其他部位，因此現(xiàn)如今常規(guī)的治療手段，如手術切除治療、化療或放療，效果并不理想。因此闡明上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制，尤其是探討上皮性卵巢癌遠處浸潤轉(zhuǎn)移機制對于上皮性卵

2、巢癌的早期診斷以及治療有指導性意義。
　　缺氧是公認的腫瘤所處的微環(huán)境，是由于腫瘤細胞的無節(jié)制增長導致組織缺氧，進而形成一個酸性的腫瘤微環(huán)境。尤其在實體腫瘤結(jié)構(gòu)中，缺氧部位可橫穿整個腫瘤組織。文獻報道，缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是缺氧誘導的重要分子，HIF可促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變和遠處侵襲轉(zhuǎn)移。其中，缺氧誘導因子1α（Hypoxia inducible factor1α，HIF1

3、α）調(diào)控腫瘤酸性微環(huán)境中碳酸酐酶9(Carbonic anhydrase，CA9)的表達，通過調(diào)控CO2水和反應，調(diào)節(jié)腫瘤細胞內(nèi)外pH值，使得腫瘤細胞能夠適應缺氧和缺氧所導致的酸性環(huán)境，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和浸潤、遠處轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用。
　　上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）進程對于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及后期進展的作用十分重要，其中就包括上皮性卵巢癌細胞。EMT可賦予上皮細胞間質(zhì)細

4、胞表型，導致細胞之間的粘附性降低、能動性增高，從而獲得侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的能力。而缺氧環(huán)境可進一步促進腫瘤細胞的EMT。抑制缺氧誘導的EMT可能是抑制腫瘤侵襲遷移的重要機制。
　　Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor2)是bHLH家族的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。實驗室前期研究顯示，Sohlh2在卵巢表面上皮

5、和輸卵管上皮中表達較高，但其在上皮性卵巢癌組織中表達水平則明顯降低。過表達Sohlh2，可通過調(diào)控不同分子機制抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這一結(jié)果表明Sohlh2是一個新的抑癌基因。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)Sohlh2可通過下調(diào)IL-8抑制人乳腺癌細胞的EMT。但是，Sohlh2對于缺氧誘導的上皮性卵巢癌EMT的作用及作用機制需進一步探討。
　　本實驗通過體外培養(yǎng)上皮性卵巢癌細胞，利用化學乏氧劑氯化鈷，模擬腫瘤細胞所處的缺氧

6、微環(huán)境;通過Sohlh2基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾，利用劃痕、Transwell遷移、Matrigel侵襲、免疫熒光染色、Western Blot等實驗技術，檢測Sohlh2在缺氧引起的上皮性卵巢癌細胞EMT及侵襲遷移中的作用，并進一步探討其作用機制，以期可以為臨床上該類腫瘤的治療發(fā)現(xiàn)新的方向。
　　方法:
　　1.檢測Sohlh2在缺氧狀態(tài)下對上皮性卵巢癌細胞遷移侵襲的影響。體外培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細胞株H08910和SKOV3，

7、采用基因轉(zhuǎn)染及RNA干擾技術，過表達或敲減Sohlh2基因。將細胞分為以下幾組:①H08910-pEGFP組;②H08910-pSohlh2組;③SKOV3-Con組;④SKOV3-pShSohlh2組，①②組細胞通過G418篩選，③④組細胞通過puromycin篩選，篩選時間為兩周，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的Sohlh2過表達以及Sohlh2敲減細胞系。四組細胞中加入100μM CoCl2缺氧處理48h。采用劃痕、Transwell遷移、Matrig

8、el侵襲實驗，檢測Sohlh2在缺氧狀態(tài)的上皮性卵巢癌細胞遷移侵襲中的作用。
　　2.檢測Sohlh2對缺氧誘導的上皮性卵巢癌細胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變過程的作用。采用Western Blot技術，檢測H08910-pEGFP組、H08910-pSohlh2組、SKOV3-Con組、SKOV3-pShSohlh2組細胞經(jīng)過100μ M CoCl2缺氧處理48h后，上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變標志物E-cadherin、Vimentin、N-cadher

9、in和Sohlh2蛋白表達水平的變化;采用免疫熒光技術，檢測H08910-pEGFP組和H08910-pSohlh2組細胞經(jīng)過缺氧處理后E-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平的變化。
　　3.探討Sohlh2在缺氧誘導的上皮性卵巢癌細胞EMT中的作用機制。
　　將H08910-pEGFP組、H08910-pSohlh2組、SKOV3-Con組、SKOV3-pShSohlh2組細胞分別在正常氧氣含量(25％ O2

10、)及缺氧狀態(tài)(100μ M CoCl2)下進行培養(yǎng)，采用Western Blot技術，檢測HIF1α和CA9的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過缺氧處理48h后，與H08910-pEGFP組相比，H08910-pSohlh2組48小時細胞遷移的距離明顯縮短(P＜0.05);Transwell遷移和Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示:H08910-pSohlh2組遷移、侵襲的細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。
　　經(jīng)過

11、缺氧處理48h后，與SKOV3-Con組相比，SKOV3-pShSohlh2組48小時細胞遷移的距離明顯增加(P＜0.05); Transwell遷移和Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示:SKOV3-pShSohlh2組遷移、侵襲的細胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示:經(jīng)過缺氧處理48h后，與H08910-pEGFP組相比，H08910-pSohlh2組上皮性標志物E-cadherin蛋白表達明顯增加，Vime

12、ntin蛋白表達降低。
　　3.經(jīng)過缺氧處理后，與H08910-pEGFP組對比，上皮性標志物蛋白E-cadherin表達明顯升高，間質(zhì)性標志物Vimentin和N-cadherin蛋白表達明顯降低;與SKOV3-Con組相比，SKOV3-pShSohlh2組上皮性標志物蛋白E-cadherin表達明顯減少，Vimentin和N-cadherin表達升高。
　　4.在正常氧氣含量及缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)H08910-pEGFP組和H

13、08910-pSohlh2組細胞，缺氧狀態(tài)下H08910細胞HIF1α和CA9的蛋白表達明顯高于正常氧氣含量培養(yǎng)細胞的蛋白表達量;在正常氧氣含量和缺氧狀態(tài)下，與H08910-pEGFP組對比，H08910-pSohlh2組HIF1α和CA9的蛋白表達量均明顯降低。
　　在正常氧氣含量及缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)SKOV3-Con組和SKOV3-pShSohlh2組，缺氧狀態(tài)下SKOV3細胞HIF1α和CA9的蛋白表達量較正常氧氣含量培養(yǎng)細胞的