負載脂肪干細胞的生物活性補片在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究.pdf

1、盆底重建手術(shù)植入人工合成材料后,可出現(xiàn)侵蝕(erosion)、暴露(exposure)、收縮(constraction)、性交痛(dyspareunia)、瘺管(fistula)等術(shù)后并發(fā)癥。研究者們一直在尋找一種既能保證療效,降低術(shù)后復發(fā)率及并發(fā)癥,又能改善其潛在病理生理損傷的治療措施,以更好的治療女性盆底功能障礙性疾病。細胞治療和組織工程技術(shù)在女性盆底重建外科學的研究中逐漸受到關(guān)注,是女性盆底重建外科學的一個新的發(fā)展領(lǐng)域。然而組織工

2、程生物活性材料修復時,其移植的干細胞在體內(nèi)的生存時間、長期存活量、分布,以及支架材料在體內(nèi)的降解情況仍未闡明。
　　本研究先體外雙重標記綠色熒光蛋白和熒光素酶于脂肪干細胞,復合ABP移植裸鼠體內(nèi),然后利用先進的小動物活體成像系統(tǒng)活體內(nèi)實時動態(tài)追蹤移植細胞的存活、分布,利用組織學及免疫組化評估生物活性材料的轉(zhuǎn)歸,探索其修復的可行性,為其在女性盆底重建中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　【方法】
　　1、生物活性補片的體外制備

3、　　1.1人ASCs的分離培養(yǎng)、鑒定、標記及刷選
　　(1)從整形外科女性患者(患者知情同意并簽知情同意書)抽脂手術(shù)中取出脂肪組織20ml,采用酶消化法、差速貼壁法體外分離培養(yǎng)人脂肪干細胞,在普通倒置顯微鏡下觀察記錄其形態(tài)特點、增殖特征,流式細胞儀鑒定脂肪干細胞的表面標記物,證明多向分化能力。
　　(2)雙報告基因——增強型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein, eGFP)和熒光素

4、酶蛋白(Luciferase, Luc)以攜帶嘌呤霉素抗性基因的慢病毒為載體感染第三代人脂肪干細胞,轉(zhuǎn)染后倒置熒光顯微鏡觀察eGFP的表達情況。
　　(3)利用嘌呤霉素對eGFP·Luc-hASCs進行刷選,提高慢病毒轉(zhuǎn)染率,利用流式細胞技術(shù)檢測eGFP·Luc-hASCs的轉(zhuǎn)染率。
　　1.2建立體內(nèi)、外生物發(fā)光顯像量效標準曲線
　　(1)體外將eGFP·Luc-hASCs按照細胞個數(shù)(10,100,500,1000

5、,5000,10000)個/100μL鋪于96孔板,加入熒光素在活體成像儀中生物發(fā)光成像,繪制細胞量和發(fā)光量的線性曲線。
　　(2)體內(nèi)將eGFP·Luc-hASCs按照細胞個數(shù)(1×106/100μL,1×105/100μL,1×104/100μL,1×103/100μL,100/100μL)注射裸鼠背部,腹腔注射熒光素活體成像,繪制體內(nèi)細胞量和生物發(fā)光量的標準曲線為后續(xù)實驗定量分析體內(nèi)移植細胞的數(shù)量做準備。
　　1.3體

6、外ASCs和ABP共培養(yǎng)
　　(1)采第八代eGFP·Luc-hASCs在體外與脫細胞牛心包膜(ABP)共培養(yǎng)(上海欣吉特生物科技有限公司提供)。
　　(2) CCK-8法檢測eGFP·Luc-hASCs在脫細胞牛心包膜上的增殖。將第8代eGFP·Luc- hASCs接種于ABP后,連續(xù)7天加入CCK-8測吸光度值,制作細胞的生長曲線。
　　2、生物活性補片的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸
　　2.1生物活性補片的體內(nèi)移植:30只裸鼠

7、隨機分為三組,CO-CULTURE組(n=10):體外共培養(yǎng)eGFP·Luc-hASCs和ABP再植入裸鼠背部; LOCAL-INJE組(n=10):ABP植裸鼠背部后,eGFP·Luc-hASCs直接注射移植部位,無體外共培養(yǎng);BLANK組(n=10):單純植入ABP裸鼠背部。
　　2.2生物活性補片的體內(nèi)評估:
　　(1)分別于移植后1天,1周,2周,3周,4周,6周,8周,12周在裸鼠腹腔注射熒光素活體生物發(fā)光成像實時

8、動態(tài)觀察eGFP·Luc-hASCs在體內(nèi)的存活、分布;
　　(2)移植12周后裸鼠體內(nèi)取出移植物、心、肝、肺等組織快速冰凍DAPI染色觀察eGFP的表達;病理HE染色,Masson染色、免疫組織化學染色觀察評價生物活性補片體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。
　　【結(jié)果】
　　1、傳代培養(yǎng)的hASCs形態(tài)呈旋渦狀、輻射狀排列,體外增殖穩(wěn)定。慢病毒介導雙報告基因eGFP和Luc轉(zhuǎn)染hASCs,體外熒光顯微鏡可觀察到eGFP高表達。流式細胞儀檢

9、測示eGFP·Luc-hASCs的轉(zhuǎn)染率達91.12％。
　　2、熒光顯微鏡觀察示eGFP·Luc-hASCs在ABP上黏附生長良好,CCK-8顯示活性生物補片中細胞增殖能力與未接種于脫細胞牛心包膜的hASCs無明顯區(qū)別。
　　3、體內(nèi)外細胞梯度生物發(fā)光成像顯示,細胞量和活體成像的發(fā)光量成線性關(guān)系,繪制量效關(guān)系曲線后可量化體內(nèi)移植細胞的數(shù)量。
　　4、活性生物補片移植后12周活體連續(xù)成像顯示,移植的脂肪干細胞可長期存活

10、,移植前3周細胞存活數(shù)量急劇下降,3周后達到平臺期,12周仍可監(jiān)測到存活的細胞;移植細胞主要分布移植部位,未發(fā)現(xiàn)向其他重要臟器明顯遷移。
　　5、快速冰凍 DAPI染色后可在細胞移植部位發(fā)現(xiàn) eGFP的表達,證實移植細胞的存在,主要存在皮下組織,心、肺、肝未見明顯 eGFP的表達;HE染色發(fā)現(xiàn)LOCAL-INJE組移植材料內(nèi)細胞數(shù)量、血管密度最豐富的, CO-CULTURE組其次,對照組最少。Masson染色LOCAL-INJE組