熒光磁性納米粒子標(biāo)記三維培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在急性肝衰竭動物體內(nèi)的歸巢.pdf

1、背景：間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一類具有自我復(fù)制和多向分化能力的成體干細(xì)胞，存在于人體的多種組織器官中。國內(nèi)外許多的臨床試驗已經(jīng)表明間充質(zhì)干細(xì)胞在治療多種疾病中具有良好的安全性與有效性，這些結(jié)果使其成為細(xì)胞治療與組織工程研究的有力工具。然而大量臨床轉(zhuǎn)化研究報告中所涉及的間充質(zhì)干細(xì)胞，在經(jīng)過體外大量擴(kuò)增后，早已脫離了間充質(zhì)干細(xì)胞特性的軌道，發(fā)生了復(fù)制性衰老，已無法維持其“干性”這一重要特征，結(jié)

2、果導(dǎo)致臨床治療效果不穩(wěn)定，從而在臨床應(yīng)用的分析中產(chǎn)生了極大的困惑。有報道稱干細(xì)胞都有其特異性的生長微環(huán)境（Niche），而細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix,ECM）是微環(huán)境的重要組成部分，為維持細(xì)胞功能提供關(guān)鍵的生化與物理信號。所以我們利用細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)體外模擬間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)所需的三維微環(huán)境。以此來獲得臨床級數(shù)量并具有“干性”維持能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　急性肝衰竭（Acute Liver Failure,A

3、LF）是突然出現(xiàn)的一種大面積肝細(xì)胞壞死和肝功能顯著異常綜合征，嚴(yán)重時可能會發(fā)生多臟器功能衰竭，死亡率極高。已經(jīng)有實驗證明干細(xì)胞在肝臟疾病的治療過程中具有很好的療效。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADMSCs）作為一種新型的細(xì)胞治療種子細(xì)胞，具有取材容易，含量豐富，增殖能力強(qiáng)，多系分化能力，免疫原性極低等優(yōu)點，在急性肝衰竭的臨床治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。然而脂肪來源間

4、充質(zhì)干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的歸巢問題目前還僅局限于歸巢受損部位的結(jié)論。熒光磁性納米粒子（Fluorescent Magnetic Nano-Particles,FMNPs）作為一種新的生物標(biāo)記探針，能夠高效的標(biāo)記干細(xì)胞，生物相容性好，移植后便于檢測等優(yōu)點，可用來解決脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞在急性肝衰竭動物體內(nèi)的歸巢問題。以便為今后的細(xì)胞治療提供更多的理論依據(jù)。
　　第一章、人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的：利用ECM

5、系統(tǒng)，體外分離擴(kuò)增具有“干性”維持能力的ADMSCs，以獲得臨床級數(shù)量的細(xì)胞。
　　方法：采用酶消化貼壁法獲得脂肪組織中的血管基質(zhì)部分（Stromal Vascular Fraction，SVF），脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度接種于ECM預(yù)處理的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。取第5代生長對數(shù)期細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記，成骨、成脂、成軟骨的誘導(dǎo)分化實驗檢測其多向分化能力，集落形成單元實驗檢測其單個細(xì)胞增值能力。
　　結(jié)果

6、：流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示利用ECM系統(tǒng)擴(kuò)增的ADMSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166，HLA-ABC以及SSEA-4。ADMSCs可以很好的向成骨、成脂以及成軟骨方向分化。
　　結(jié)論：利用ECM系統(tǒng)，成功大規(guī)模擴(kuò)增具有“干性”維持能力的ADMSCs。
　　第二章、熒光磁性納米粒子標(biāo)記人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞
　　目的：利用FMNPs對ADMSCs進(jìn)行標(biāo)記

7、并檢測。
　　方法：取第5代生長對數(shù)期的ADMSCs，加入適量濃度FMNPs，避光孵育過夜。普魯士藍(lán)染色、激光共聚焦顯微鏡觀察來檢測FMNPs對ADMSCs標(biāo)記。
　　結(jié)果：普魯士藍(lán)染色實驗中脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的胞質(zhì)呈藍(lán)色，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞核被染成藍(lán)色，而細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色。
　　結(jié)論：熒光磁性納米粒子可能是通過胞吞形式標(biāo)記脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。
　　第三章、熒光磁性納米粒子標(biāo)記脂肪間充質(zhì)干

8、細(xì)胞在急性肝衰竭動物體內(nèi)的歸巢
　　目的：將FMNPs標(biāo)記的ADMSCs尾靜脈移植入ALF動物體內(nèi)，通過熒光成像儀觀察被標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)的歸巢情況。
　　方法：孵育24小時FMNPs的ADMSCs在避光條件下消化，制成細(xì)胞懸液，尾靜脈移植ALF動物，檢測肝功能生化指標(biāo)：谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)苷酶（Alanine aminotransferase，ALT）和血清白蛋白（Se

9、rum albumin,ALB）。將心臟，肝臟，脾臟，肺，腎臟，腦組織取出生理鹽水清洗，置于透明托盤內(nèi)，熒光成像儀觀察被標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢。
　　結(jié)果：移植ADMSCs后，AST和ALT含量明顯下降，ALB含量升高。移植入ALF動物體內(nèi)的細(xì)胞主要?dú)w巢于腦部和肝臟，其他組織器官中被標(biāo)記細(xì)胞含量極少。
　　結(jié)論：ADMSCs可以有效改善ALF動物的肝功能狀態(tài)，被標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)主要?dú)w巢于腦部和肝臟，且隨著時間的推移，被標(biāo)記細(xì)