三維微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞橫向分化為肝樣細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景/目的： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是源于骨髓的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，且取材容易，易于在體外培養(yǎng)擴增，免疫源性低，便于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達調(diào)控。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)MSCs在體內(nèi)外都具有肝樣細(xì)胞分化的潛能。將MSCs直接輸入體內(nèi)，可以在發(fā)生損傷病變的肝臟內(nèi)分化為肝細(xì)胞；在體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSCs也可以定向分化為肝樣細(xì)胞。 原代肝細(xì)胞難以在體外擴

2、增培養(yǎng)，而且常常不能維持正常的生理功能。誘導(dǎo)分化后的肝樣細(xì)胞則能夠大量擴增，又具備肝細(xì)胞分泌和解毒的功能，將能很好地替代正常肝細(xì)胞在科研和臨床上的應(yīng)用：①為肝臟疾病的細(xì)胞移植治療和基因治療提供可利用的細(xì)胞庫；②誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞可制成人工肝臟體外生物反應(yīng)器，一方面幫助治療肝功能衰竭的病人，另一方面生產(chǎn)肝細(xì)胞分泌的多種蛋白、因子；⑧用于構(gòu)建藥代動力學(xué)反應(yīng)器，檢測藥物肝代謝途徑和毒性。 目前，如何創(chuàng)造最優(yōu)化的誘導(dǎo)分化環(huán)境，最大效率地獲

3、取分化成熟的肝樣細(xì)胞，仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究把大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)作為研究對象，以最大程度地獲取肝樣分化細(xì)胞為宗旨，比較并驗證不同培養(yǎng)條件下rMSCs的分化效率。目的在于探索出更優(yōu)化的誘導(dǎo)分化條件，最終應(yīng)用于誘導(dǎo)人MSCs的肝樣分化，為臨床肝功能衰竭的細(xì)胞和基因治療、生物人工肝體外生物反應(yīng)器以及藥代動力學(xué)反應(yīng)器提供種子細(xì)胞。 方法： 第一章：肝細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究。

4、 1、分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)。 2、通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX2-GFP，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，獲得完整的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 3、病毒感染rMSCs，篩選出表達綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞克隆rMSCs-GFP，擴增培養(yǎng)，并在激光共聚焦顯微鏡下檢測GFP的表達。 4、分離原代大鼠肝細(xì)胞，與rMSCs-GFP共培養(yǎng)，并以肝細(xì)胞生長因子(HGF)處理組作為對照

5、(20ng/mL)。 5、倒置顯微鏡下觀察不同時間點細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。 6、在共培養(yǎng)第3、7、14和21天，用流式細(xì)胞儀分選器分離出表達GFP的rMSCs。 7、以MTT法檢測共培養(yǎng)21天后分選所得rMSCs的增殖活性。 8、分別以RT-PCR法和免疫熒光技術(shù)檢測分選獲取rMSCs的ALB、AFP和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表達情況。 9、以Periodic acid-Schiff法檢

6、測細(xì)胞內(nèi)肝糖原的表達。 第二章：肝細(xì)胞生長因子和懸滴培養(yǎng)共同誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究。 1、通過懸滴的方式使rMSCs形成細(xì)胞球，提供一種三維培養(yǎng)環(huán)境，同時加入HGF作為誘導(dǎo)因子。 2、培養(yǎng)第7、14和21天后，以RT-PCR法和免疫熒光技術(shù)檢測rMSCs的ALB、APF和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表達情況。 3、ELISA檢測培養(yǎng)液上清中ALB的分泌。 第三章：表達人

7、肝細(xì)胞生長因子的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究。 1、通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pL,NCX2-hHGF，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。 2、病毒感染rMSCs，篩選出表達址tGF的陽性克隆(rMSCs-hHGF)，擴增培養(yǎng)。 3、RT-PCR法檢測rMSCs內(nèi)hHGF基因的mRNA表達；免疫熒光法檢測hHGF蛋白表達；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中hHGF蛋白的分泌。

8、 4、懸滴培養(yǎng)rMSCs-hHGF，在培養(yǎng)7、14和21天后，以RT-PCR法和免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞的ALB、APF和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表達情況。 5、ELISA檢測培養(yǎng)液上清中ALB的分泌。 結(jié)果： 第一章：肝細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究。 構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX2-GFP，包裝為具有感染力的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，成功感染rMSCs，獲得穩(wěn)定表達GFP

9、的細(xì)胞株。 在rMSCs-GFP與原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，細(xì)胞由長梭形、貼壁生長轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅?、圓形懸浮生長，并相互聚集成團塊、球形結(jié)構(gòu)，同時也保持了良好的細(xì)胞活性和增殖力。優(yōu)化流式細(xì)胞儀分選方案，獲取了高純度的rMSCs-GFP(98﹪±)。 RT-PCR結(jié)果顯示，與肝細(xì)胞共培養(yǎng)的rMSCs-GFP在第3天就開始在基因水平上表達ALB、AFP和CKl8，并在此后的第7、14和21天表達增強；HGF處理組則在第14天才有

10、較弱的表達。 免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示，在第3到21天中，與肝細(xì)胞共培養(yǎng)的rMSCs-GFP呈現(xiàn)ALB和CK18較強陽性表達，而AFP則較弱表達；HGF處理組中，直到第21天才出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ALB、AFP和CK18的弱陽性表達。 rMSCs-GFP與肝細(xì)胞共培養(yǎng)的第7天就具備了糖原儲存的功能；而在整個培養(yǎng)過程中，HGF誘導(dǎo)后，rMSCs并不具備該功能。 第二章：肝細(xì)胞生長因子和懸滴培養(yǎng)共同誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化

11、為肝樣細(xì)胞的研究。 rMSCs經(jīng)過懸滴培養(yǎng)后，細(xì)胞緊密聚集成球形，組織切片顯示細(xì)胞球內(nèi)部呈現(xiàn)管狀中空。RT-PCR結(jié)果顯示，EGF懸滴培養(yǎng)的rMSCs，在第7天出現(xiàn)了ALB、AFP和CK-18 mRNA的弱陽性表達，其中ALB表達相對較強。EGF+HGF懸滴培養(yǎng)的rMSCs，在第7天即出現(xiàn)ALB和CK-18 mRNA的強陽性表達，而AFP則表達較弱，并持續(xù)到第21天。對比EGF懸滴培養(yǎng)，CK-18 mRNA的表達也相對較強。相應(yīng)

12、地，EGF懸滴培養(yǎng)rMSCs，細(xì)胞內(nèi)AFP陽性表達出現(xiàn)在第14天，第21天時有所增強，ALB在整個培養(yǎng)過程都呈現(xiàn)弱陽性表達，且有不斷增強的趨勢，而CK-18的蛋白表達則一直呈現(xiàn)陰性；EGF+HGF懸滴培養(yǎng)rMSCs，細(xì)胞內(nèi)AFP在第14天呈現(xiàn)陽性表達，并在第21天時表達增強，而ALB和CK-18這兩種蛋白，在第7天就呈現(xiàn)較強陽性表達，直到21天為強陽性表達。 從第1周到第3周，ELISA檢測到EGF+HGF懸滴培養(yǎng)后rMSCs的

13、ALB分泌量分別為50.25±5.32，55.03±7.45和54.92±3.18(ng/dish/d)；而EGF懸滴培養(yǎng)則分別為0.52±0.44，0.88±1.33和9.7±4.60(ng/dish/d)。兩者在不同時間點上的分泌量具有統(tǒng)計學(xué)上顯著差異(p<0.01)。 第三章：表達人肝細(xì)胞生長因子的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究。 構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX2-hHGF，包裝為具有感染力的逆轉(zhuǎn)

14、錄病毒，成功感染rMSCs，經(jīng)過G418篩選獲得穩(wěn)定表達hHGF的細(xì)胞株。RT-PCR和免疫熒光檢測都證實rMSCs-hHGF有hHGF mRNA和蛋白表達，ELISA檢測培養(yǎng)上清也說明該細(xì)胞能夠?qū)HGF分泌到胞外，且分泌量保持在一恒定水平(123.71±8.81 ng/ml)。 RT-PCR結(jié)果顯示，EGF懸滴培養(yǎng)的rMSCs-hHGF，在第7天即可出現(xiàn)ALB、AFP和CK-18 mRNA的陽性表達，其中ALB表達最強；細(xì)胞

15、內(nèi)AFP在第21天始出現(xiàn)陽性表達，而ALB和CK-18這兩種蛋白，在第7天就呈現(xiàn)較強陽性表達，并持續(xù)到第21天。 從第1周到第3周，ELISA檢測到EGF懸滴培養(yǎng)后rMSCs-hHGF的ALB分泌量分別為46.32±3.31，42.17±8.53和50.06±5.78(ng/dish/d)。 結(jié)論： 與肝細(xì)胞共培養(yǎng)的過程中，rMSCs在分化為肝樣細(xì)胞的同時，形成球形或團塊狀立體結(jié)構(gòu)，我們就考慮該立體結(jié)構(gòu)有可能促進

16、和維持rMSCs的分化。于是，我們通過懸滴培養(yǎng)的方法，為rMSCs創(chuàng)造一種球形三維培養(yǎng)微環(huán)境，在EGF和/或HGF的作用下，成功地誘導(dǎo)了rMSCs分化為肝樣細(xì)胞。不同的誘導(dǎo)因子對rMSCs具有不同的誘導(dǎo)效應(yīng)：而HGF在此過程中起著重要作用。因此，我們以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)，把hHGF基因?qū)雛MSCs中，繼而通過懸滴培養(yǎng)的方式又成功地誘導(dǎo)其向肝樣細(xì)胞的方向分化。綜上所述，立體三維空間培養(yǎng)為MSCs的肝樣細(xì)胞分化提供了優(yōu)化的誘導(dǎo)微環(huán)境，有效地提