瀕危名貴藥用霍山石斛類(lèi)原球莖液體培養(yǎng)生產(chǎn)活性多糖的研究.pdf

1、石斛作為傳統(tǒng)名貴中草藥，其資源再生，化學(xué)成分和藥理活性逐漸引起人們的關(guān)注，多糖是石斛屬植物中主要的藥用活性成分之一。本文以傳統(tǒng)的名貴珍稀藥用植物——霍山石斛為主要研究對(duì)象，在建立霍山石斛類(lèi)原球莖多糖高效表達(dá)懸浮培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，利用生物大分子研究的最新技術(shù)和現(xiàn)代分離分析手段與藥理實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)霍山石斛類(lèi)原球莖水溶性多糖進(jìn)行了提取分離純化，并對(duì)其主要活性多糖組分HPS-1B23的組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下： （1）以

2、霍山石斛試管苗莖段為外植體，首次誘導(dǎo)獲得了類(lèi)原球莖，并建立了類(lèi)原球莖的培養(yǎng)體系。其中附加NAA（7.5μmol L<’-1>）和KIN（0.5μmol L<’-1>）組合的MS培養(yǎng)基最利于類(lèi)原球莖的形成，誘導(dǎo)率達(dá)到79.9％。誘導(dǎo)的類(lèi)原球莖經(jīng)長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)后，從生長(zhǎng)、植株再生、活性多糖合成、藥理作用、單糖組成及基因組DNA多態(tài)性等方面進(jìn)行品質(zhì)穩(wěn)定性分析，表明誘導(dǎo)獲得的類(lèi)原球莖系在品質(zhì)上是穩(wěn)定的。 （2）藥理學(xué)研究證明了培養(yǎng)的類(lèi)原球

3、莖具有野生霍山石斛同樣的合成活性多糖的能力。野生霍山石斛總多糖能顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分別產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，多糖作用濃度分別在800μg mL<’-1>和200μg mL<’1>。RT-PCR分析表明，總多糖是通過(guò)上調(diào)或下調(diào)IFN-γ和TNF-α的基因表達(dá)來(lái)控制各自的釋放量的。經(jīng)DEAE-Cellulose離子交換色譜層析，從類(lèi)原球莖總多糖中分離出和野生霍山石斛相同的5個(gè)多糖組分，并表現(xiàn)出同樣的促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分

4、別產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的能力，其中以水洗脫部分HPS-1含量最大。建立的多糖活性評(píng)價(jià)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)霍山石斛類(lèi)原球莖培養(yǎng)體系的質(zhì)量監(jiān)控。 （3）研究分析了霍山石斛類(lèi)原球莖液體培養(yǎng)過(guò)程中碳、氮代謝特征，闡明霍山石斛類(lèi)原球莖生長(zhǎng)和多糖合成與細(xì)胞內(nèi)源和外源碳、氮的關(guān)系。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，沒(méi)有觀察到顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期，培養(yǎng)30d后，生物量達(dá)到最大，多糖合成與類(lèi)原球莖生長(zhǎng)表現(xiàn)出了非同步的關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)啟動(dòng)后，在前3d培養(yǎng)基中蔗糖濃度減

5、少了一半，同時(shí)無(wú)葡萄糖和果糖的存在，之后隨著蔗糖濃度的繼續(xù)下降，培養(yǎng)基中逐漸檢測(cè)到有葡萄糖和果糖的存在，到第9d含量達(dá)到最大值。相反，類(lèi)原球莖內(nèi)源蔗糖隨培養(yǎng)的啟動(dòng)，在培養(yǎng)的前6d，快速積累，之后快速被消耗；內(nèi)源葡萄糖和果糖含量也同時(shí)有一定程度的增加，培養(yǎng)9d后逐漸被消耗?？扇芩嵝哉崽敲负蛪A性蔗糖酶隨類(lèi)原球莖培養(yǎng)的啟動(dòng)逐漸被激活，分別在培養(yǎng)的第6d和第18d活性達(dá)到最大值。細(xì)胞壁蔗糖酶在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中活性很低，一直處于被抑制的狀態(tài)。蔗糖合

6、成酶在培養(yǎng)的第18d活性達(dá)到最高，而蔗糖磷酸合成酶與細(xì)胞壁蔗糖酶相類(lèi)似，活性一直保持很低的水平。培養(yǎng)基中NH<,4><’+>在啟動(dòng)培養(yǎng)9d后幾乎消耗殆盡，而類(lèi)原球莖對(duì)NO<,3><’->的吸收利用才剛剛開(kāi)始；胞內(nèi)NH<,4><’+>在培養(yǎng)的前3d含量急劇上升，之后又快速被消耗，直到培養(yǎng)的第12d，此時(shí)類(lèi)原球莖對(duì)NO<,3><’->的利用才啟動(dòng)。谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶隨培養(yǎng)的啟動(dòng)，活性逐漸提高，分別在培養(yǎng)的第12d和15d活性達(dá)到最

7、大值。硝酸還原酶是細(xì)胞對(duì)NO<,3><’->利用涉及的第一個(gè)關(guān)鍵性酶，在類(lèi)原球莖培養(yǎng)初期，活性表達(dá)受到了一定程度的抑制作用，培養(yǎng)9d后，活性表達(dá)逐漸提高，到第15d活性達(dá)到最大值。結(jié)果表明soluble acid IT、alkaline IT、SS、GS、GOGAT和NR在類(lèi)原球莖生長(zhǎng)的不同階段調(diào)控碳和氮代謝，最終影響類(lèi)原球莖生長(zhǎng)和多糖合成。研究結(jié)果為培養(yǎng)體系的優(yōu)化和提高多糖合成的提供理論指導(dǎo)。 （4）建立了霍山石斛類(lèi)原球莖兩階

8、段培養(yǎng)高水平合成活性多糖的體系。在生長(zhǎng)階段，通過(guò)培養(yǎng)基組成的優(yōu)化組合，獲得適合類(lèi)原球莖生長(zhǎng)的最適碳、氮源是蔗糖和硝酸鉀，濃度分別為35g L<'-1>和30mmol L<'-1>，最適Ca<'2+>、Fe<'2+>、Mn<'2+>和Zn<'2+>分別為4.5mmol L<'-1>、0.1mmolL<'-1>、0.5mmol L<'-1>和0.06mmol L<'-1>。在優(yōu)化的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上類(lèi)原球莖培養(yǎng)30d生物量達(dá)到693g FW L<

9、'-1>，生物量增加比優(yōu)化前提高了230％。在多糖合成階段，在培養(yǎng)基中補(bǔ)加蔗糖迅速促進(jìn)多糖的合成，以在培養(yǎng)第30d補(bǔ)加50g L<'-1>的蔗糖類(lèi)原球莖中多糖合成能力最高，在補(bǔ)加蔗糖繼續(xù)培養(yǎng)6天多糖產(chǎn)率達(dá)22g L<'-1>，是對(duì)照的近10倍。 （5）對(duì)霍山石斛類(lèi)原球莖活性多糖進(jìn)行了純化分析，獲得單組分活性多糖HPS-1823，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了表征，闡明了它的一級(jí)結(jié)構(gòu)?；羯绞乃苄远嗵且来谓?jīng)DEAE-纖維素離子交換色譜、Sep

10、hacryl S-200、Sephadex G-75和Sephadex G-100凝膠滲透柱色譜分離純化，首次分離得到1種均一性多糖HPS-1B23，為主要多糖組分。該活性組分為白色粉末，掃描電鏡觀察呈蜂窩狀，紫外光譜和紅外光譜掃描分析它是典型的糖類(lèi)物質(zhì)且不含蛋白質(zhì)，分子量和比旋光度分別為2.2×10<'4>a和+130.7。全水解分析證明活性組分HPS-1B23主要由葡萄糖（Glu）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）按31：10：8