霍山石斛多糖消化穩(wěn)定性研究.pdf

1、本文以霍山石斛多糖(DHP-2A)為研究材料，采用柱前熒光衍生-高效液相色譜法研究熒光標(biāo)記的霍山石斛多糖（DHP-2A-tyr-FITC）在體內(nèi)胃腸道中分子量的變化行為，然后通過(guò)體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，探索霍山石斛多糖在胃腸道中降解機(jī)制，最后對(duì)胃腸道中穩(wěn)定存在的霍山石斛多糖片段進(jìn)行體外制備。取得的研究結(jié)果如下:
　　(1)制備了熒光標(biāo)記的霍山石斛多糖（DHP-2A-tyr-FITC）。本文采用間接法對(duì)霍山石斛多糖

2、(DHP-2A)進(jìn)行熒光標(biāo)記，首先利用霍山石斛多糖(DHP-2A)的還原性末端醛基在氰基硼氫化鈉的催化下與酪胺反應(yīng)生成霍山石斛多糖-酪胺復(fù)合物(DHP-2A-tyr)，然后DHP-2A-tyr的仲氨基在弱堿條件下與異硫氰酸熒光素(FITC)的氰基發(fā)生親核反應(yīng)，生成霍山石斛多糖-酪胺-異硫氰酸復(fù)合物（DHP-2A-tyr-FITC），進(jìn)而達(dá)到對(duì)霍山石斛多糖的標(biāo)記。該熒光標(biāo)記法是在多糖的末端進(jìn)行選擇性標(biāo)記，不會(huì)破壞多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及影響多糖的

3、生物學(xué)特征。
　　(2)分析了霍山石斛多糖（DHP-2A）在消化道中的變化行為?；诙嗵菬晒鈽?biāo)記技術(shù)，采用熒光檢測(cè)器和高效液相色譜儀追蹤霍山石斛多糖(DHP-2A)口服0～24 h內(nèi)在小鼠的胃、小腸、大腸、糞便、尿液及血液中的變化狀況。結(jié)果顯示:在小鼠的胃和小腸中除了檢測(cè)到霍山石斛多糖(DHP-2A)外，還檢測(cè)到了一個(gè)新的熒光物質(zhì)且該物質(zhì)的洗脫時(shí)間滯后于霍山石斛多糖（DHP-2A），而在小鼠的大腸及糞便中只檢測(cè)到霍山石斛多糖（DH

4、P-2A），在小鼠的血液中只檢測(cè)到新物質(zhì)的熒光信號(hào)且該物質(zhì)的洗脫時(shí)間與胃和小腸中檢測(cè)的新物質(zhì)的洗脫時(shí)間相似。以上實(shí)驗(yàn)表明，霍山石斛多糖(DHP-2A)經(jīng)口服作用進(jìn)入胃腸道后可能發(fā)生了降解作用，生成了一個(gè)可以在胃腸道中穩(wěn)定存在的霍山石斛多糖片段。
　　(3)探索了霍山石斛多糖（DHP-2A）在胃腸道中降解的機(jī)制。首先追蹤了霍山石斛多糖在體外模擬唾液、胃液及腸液中的變化狀況，結(jié)果顯示，霍山石斛多糖（DHP-2A）在體外胃液中發(fā)生降解生

5、成一個(gè)穩(wěn)定存在的片段且其保留時(shí)間與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而在體外唾液、腸液中穩(wěn)定，這就說(shuō)明霍山石斛多糖（DHP-2A）降解的部位是小鼠的胃。然后對(duì)胃液中各種鹽及pH等具體分析，可知霍山石斛多糖（DHP-2A）在各種鹽溶液中穩(wěn)定但在酸溶液中不穩(wěn)定，這就說(shuō)明pH是使霍山石斛多糖（DHP-2A）在消化過(guò)程中分子量損失的一個(gè)主要原因。最后采用DNS法檢測(cè)霍山石斛多糖(DHP-2A)在酸溶液中的還原糖的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示霍山石斛多糖(DHP-2A)在

6、短時(shí)間內(nèi)還原糖顯著增加而隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)到一定時(shí)間的還原糖又幾乎保持不變，這就說(shuō)明糖苷鍵的斷裂是新片段形成的主要原因。綜上可知，霍山石斛多糖（DHP-2A）在體外模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)中可以生成與體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)一樣的穩(wěn)定存在的霍山石斛多糖片段，且該片段的是由胃酸引起的糖苷鍵的斷裂形成的。
　　(4)驗(yàn)證了霍山石斛多糖片段的活性及體內(nèi)穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)霍山石斛多糖(DHP-2A)及其片段的小腸粘膜免疫活性評(píng)價(jià)可知，與霍山石斛多糖(DHP-2A)