鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物化學(xué)成分的分離與鑒定.pdf

1、鐵皮石斛是我國(guó)一種傳統(tǒng)的名貴中草藥，它主要的藥用部分是其新鮮或者干燥的莖。鐵皮石斛具有滋陰補(bǔ)陽(yáng)，健胃補(bǔ)脾，潤(rùn)肺止咳的功效，還可以抗癌防癌，延年益壽。面對(duì)巨大的社會(huì)需求量，導(dǎo)致了鐵皮石斛資源短缺而且價(jià)格昂貴，但是，鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物的出現(xiàn)，可以讓目前市場(chǎng)上鐵皮石斛缺乏以及供不應(yīng)求的現(xiàn)狀得到一些緩解，通過(guò)研究鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物的化學(xué)成分，我們可以更好地了解人工栽培的鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物與純野外生長(zhǎng)的鐵皮石斛之間的區(qū)別，從而使鐵皮石斛原球

2、莖培養(yǎng)物更好地更加充分地得以利用。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴研究了通過(guò)高速逆流色譜技術(shù)從鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物中分離制備出芥子酸，此舉為石斛屬內(nèi)首次分離。分離采用的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4:6:3:7，v/v)，固定相流速為12 mL/min，流動(dòng)相流速為2 mL/min，單次進(jìn)樣200 mg，轉(zhuǎn)速800 rpm，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，固定相保留率46.67％，一步分離得到純度為93.11%的芥子酸。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

3、結(jié)果顯示，芥子酸具有較強(qiáng)的 DPPH·自由基清除能力，計(jì)算可得其IC50值為0.046mg/mL。⑵利用高速逆流色譜法進(jìn)行分離，優(yōu)化兩相溶劑系統(tǒng)后采用叔丁基甲醚-正丁醇-乙腈-水(5:1:2:6，v/v)的兩相溶劑體系，一步分離得到三種化合物，固定相流速為15mL/min，流動(dòng)相流速為1 mL/min，單次進(jìn)樣150mg，轉(zhuǎn)速800rpm，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，固定相保留率41.67%化合物I是β-D-glucopyranose1-[(E

4、)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoat，純度為97.8%；化合物II是β-D-glucopyranose1-[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoat，純度為98.4%；化合物III是1-O-sinapoyl glucopyranoside，純度為98.6%。通過(guò)HPLC測(cè)定三種化合物的純度，運(yùn)用ESI-MS，1H NMR和13 C NMR鑒定這三種化合物的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、表明，三種化合物對(duì)DPPH·具有清除作用，在濃度為0.01mg/mL-0.2 mg/mL的時(shí)候，清除率隨著濃度的增加而增加，其中化合物I的效果較差，化合物II的效果最好，經(jīng)計(jì)算得化合物I，II和III清除DPPH·自由基的IC50值分別為0.6219 mg/mL，0.0497 mg/mL和0.1111mg/mL。⑶優(yōu)化了鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物中多糖提取工藝及不同脫蛋白方法的比較。以提取溫度，提取時(shí)間，料液比三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)得到多糖最佳提

6、取工藝為提取溫度90℃、提取時(shí)間60 min、料液比1:40 g/mL，多糖提取率最高為78.51%。通過(guò)一系列單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分析比較Sevage法、鹽酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法四種脫蛋白工藝。結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶法反應(yīng)時(shí)間90 min，溫度70℃、酶含量30 U時(shí)，多糖含量85.01%，蛋白含量為5.89%，效果最為理想。Sevage溶劑脫蛋白中隨著洗脫次數(shù)的增加，多糖含量一直在減少，損失嚴(yán)重；鹽酸法中HCl濃度為25

7、%時(shí)效果最好，多糖含量52.17%，蛋白含量為4.82%；三氯乙酸法中TCA濃度為0.03 g/mL時(shí)，多糖含量最高35.50%，蛋白含量7.34%。⑷鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物提取多糖脫蛋白后經(jīng)過(guò) DEAE-52陰離子交換柱層析純化，得到DOKM-A、DOKM-B、DOKM-C、DOKM-D四個(gè)洗脫峰。DOKM-A洗脫峰經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行收集，通過(guò)Sephadex G-75柱層析純化，得到DOKM-A-1，DOKM-A-2兩個(gè)洗脫峰，經(jīng)過(guò)島

8、津高速液相檢測(cè)顯示DOKM-A-1相比DOKM-A-2純度較高，它的分子量是12 KDa。單糖組成分別為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，各單糖摩爾比為1：1.821：0.367：1.269：0.355：0.323：1.024。將得到的各部分多糖分別進(jìn)行DPPH·的清除作用實(shí)驗(yàn)，鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物總多糖對(duì)DPPH·的清除作用較好，經(jīng)過(guò)DEAE-52陰離子交換柱層析純化所得的DOKM-A、DOKM-B、DOKM