誘騙寡核苷酸技術(shù)靶向阻斷STAT3對卵巢癌生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinases/signaltransducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路是細(xì)胞因子信息從細(xì)胞外向細(xì)胞核傳遞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(SignalTransducer and Activator of Transcription3,STAT3)是該信號通路中一個至關(guān)重

2、要的轉(zhuǎn)錄因子。正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中STAT3蛋白的激活快速而短暫,STAT3持續(xù)激活與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程密切相關(guān)。目前,在多種腫瘤細(xì)胞和組織中檢測到STAT3過度激活,如乳腺癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、腦瘤、非小細(xì)胞肺癌和各種白血病等。STAT3過度激活后誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、分化、生長、凋亡密切相關(guān)的基因的異常高表達(dá),通過各種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、阻礙細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)出致癌作用。目前STAT3已

3、被定義為癌基因,其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注,成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。
　　 卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位,死亡率占第一位的惡性疾病。卵巢癌起病隱匿,進(jìn)展快,缺乏有效的早期診斷方法,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往已有盆腹腔的播散和轉(zhuǎn)移,尤其盆腹腔的轉(zhuǎn)移發(fā)生早,范圍廣,是卵巢癌患者預(yù)后不良的主要因?yàn)?。卵巢癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。因此,深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移

4、的機(jī)制,從分子水平上尋找合理有效的治療靶點(diǎn),是卵巢癌基因治療研究的目的之一。
　　 以STAT3為靶點(diǎn)進(jìn)行卵巢癌基因治療的依據(jù):(1)STAT3在卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌患者組織標(biāo)本中存在過度激活現(xiàn)象,且STAT3在人類卵巢癌發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,STAT3過度激活與卵巢癌惡性進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。(2)STAT3是多個致癌性通路匯聚的焦點(diǎn),以STAT3為靶點(diǎn)治療效應(yīng)強(qiáng)大。(3)腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活的STAT3是導(dǎo)致腫

5、瘤免疫逃逸的重大因素,以STAT3為靶點(diǎn)激活抗腫瘤免疫應(yīng)答對腫瘤治療起到事半功倍的作用。(4)轉(zhuǎn)錄因子誘騙技術(shù)是調(diào)控持續(xù)活化STAT3的有效方法。(5)腹腔注射或腹腔灌洗是STAT3誘騙寡核苷酸制劑(STAT3 decoy ODN)合理的給藥途徑。
　　 由于誘騙寡核苷酸技術(shù)成本低,特異性高,合成的寡核苷酸片段相對較穩(wěn)定,該技術(shù)已在人類多種腫瘤如肺癌、胰腺癌、頭頸部鱗癌等研究中得到應(yīng)用。然而STAT3 decoy ODN在卵巢癌

6、中的研究較少,尤其是STAT3 decoy ODN在活體內(nèi)生物學(xué)作用的研究更為少見。本課題主要探討誘騙寡核苷酸技術(shù)靶向調(diào)控STAT3信號通路對人卵巢癌細(xì)胞生長增殖、侵襲活性的影響及相關(guān)機(jī)制,研究誘騙寡核苷酸技術(shù)靶向調(diào)控STAT3信號通路對人卵巢癌裸鼠皮下種植瘤治療作用及其機(jī)制。
　　 第一部分誘騙寡核苷酸靶向阻斷STAT3對人卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用及機(jī)制研究
　　 研究目的：
　　 1.檢測陽離子脂質(zhì)體將STAT

7、3 decoy ODN轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.探討STAT3 decoy ODN對體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系生長、凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　 3.觀察STAT3 decoy ODN對體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系紫杉醇敏感性的影響。
　　 研究方法：
　　 1.應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)STAT3 decoy ODN的轉(zhuǎn)染,流式細(xì)胞術(shù)及熒光顯微鏡檢測FITC標(biāo)記STAT3

8、decoy ODN在卵巢癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.采用四甲基偶氮唑鹽(Dimethylthiazol-2-yl-diphenyl tetrazalium bromide,MTT)比色法,檢測不同濃度STAT3 decoy ODN(0,12.5,25,50nmol/L)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3和OVCAR3后在不同時間點(diǎn)(24h,48h,72h)的長抑制率(growthinhibition rate,GIR)；MTT比色法檢

9、測STAT3 decoy ODN對SKOV3、OVCAR3細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響。
　　 3.Annexin V-FITC雙染法檢測JSTAT3 decoy ODN對SKOV3、OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測STAT3 decoy ODN對SKOV3、OVCAR3細(xì)胞周期的影響。
　　 4.Western blot法檢測STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3中相關(guān)蛋白P-

10、gp、pAkt、caspase-3表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.STAT3 decoy ODN在卵巢癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率
　　 2.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用
　　 3.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響
　　 4.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞周期的影響
　　 5.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響

11、
　　 6.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 結(jié)論：
　　 1.陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的STAT3 decoy ODN能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞中,STAT3 decoy ODN能夠有效抑制人卵巢癌細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞周期從G0/G1期向S轉(zhuǎn)化,并增加卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。
　　 2.STAT3 decoy OD

12、N發(fā)揮作用的機(jī)制與降調(diào)卵巢癌細(xì)胞中P-gp、pAkt的表達(dá),以及增加細(xì)胞中凋亡相關(guān)caspase-3活性裂解片段的表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分誘騙寡核苷酸靶向阻斷STAT3對人卵巢癌細(xì)胞侵襲力影響的研究
　　 研究目的：
　　 探討STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞侵襲力的影響及其機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.應(yīng)用腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell侵襲實(shí)驗(yàn))檢測轉(zhuǎn)染STAT3 dec

13、oy ODN對卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3體外侵襲力的影響。
　　 2.應(yīng)用Western blot法檢測STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3侵襲相關(guān)蛋白EMMPRIN、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞侵襲力的影響
　　 2.STAT3 decoy ODN對卵巢癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

14、r>　　 結(jié)論：
　　 1.STAT3 decoy ODN能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的體外侵襲力。
　　 2.STAT3 decoy ODN發(fā)揮作用的機(jī)制與降調(diào)卵巢癌細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白EMMPRIN、MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分誘騙寡核苷酸靶向阻斷STAT3對人卵巢癌裸鼠種植瘤治療作用的研究
　　 研究目的：
　　 1.建立人卵巢癌裸鼠皮下種植瘤模型,探討STAT3 decoy

15、 ODN對荷瘤裸鼠的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)。
　　 2.探討STAT3 decoy ODN體內(nèi)抗瘤效應(yīng)的機(jī)制及對裸鼠正常器官的影響。
　　 研究方法：
　　 1.皮下注射法將常規(guī)培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞(濃度:2×107/ml)接種到裸鼠右側(cè)胸部皮下,裸鼠在無菌SPF級的動物培養(yǎng)設(shè)備中飼養(yǎng)。
　　 2.接種后約12天,待皮下腫瘤結(jié)節(jié)明顯觸到,將裸鼠隨機(jī)分成三組,分別給予STAT3 decoy ODN、STAT3 dec

16、oy ODN、PBS隔日瘤周注射,連續(xù)處理30天；通過監(jiān)測腫瘤體積及治療結(jié)束后瘤體重量,評價(jià)其對荷瘤裸鼠的抗瘤效應(yīng)。
　　 3.治療結(jié)束后,取腫瘤組織及裸鼠心、肝、腎組織,制作石蠟切片,HE染色鏡檢。
　　 4.TUNEL法檢測STAT3 decoy ODN在體內(nèi)對人卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　 5.應(yīng)用Western blot法檢測STAT3 decoy ODN對裸鼠腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白

17、表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.STAT3 decoy ODN對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制作用
　　 2.STAT3 decoy ODN能夠誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡
　　 3.STAT3 decoy ODN對腫瘤組織及裸鼠心、肝、腎組織的影響
　　 4.STAT3 decoy ODN在體內(nèi)對腫瘤侵襲相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
　　 結(jié)論：
　　 1.人卵巢癌細(xì)胞SKO