誘騙性寡核苷酸涂層支架預(yù)防血管介入術(shù)后再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 近年來(lái)由于藥物洗脫支架的發(fā)明和完善,冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率明顯降低,但實(shí)驗(yàn)表明雷帕霉素等經(jīng)典涂層藥物在抑制新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞過(guò)渡增殖的同時(shí),也抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù),從而易導(dǎo)致晚期血栓的形成,再次梗塞發(fā)生率增加。尋找特異性高的生物制劑一既選擇性抑制平滑肌細(xì)胞的增生,又加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù),成為許多研究者的奮斗目標(biāo)。
　　 誘騙性寡核苷酸主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而阻礙其與下游基因啟動(dòng)子或增

2、強(qiáng)子核心序列結(jié)合,達(dá)到降低下游基因表達(dá)的目的。眾多研究已經(jīng)證明該方法是一種有潛力的分子治療手段。目前轉(zhuǎn)錄因子E2F和NFkB誘騙性寡核苷酸已廣泛應(yīng)用于體外移植血管阻塞等疾病的防治研究,且有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)無(wú)明顯抑制作用,為支架內(nèi)再狹窄的預(yù)防帶來(lái)了新的曙光。
　　 但既往誘騙性寡核苷酸研究多采用局部灌注或體外浸泡等一過(guò)性轉(zhuǎn)染方式,限制了其療效,所以本研究以明膠涂層支架為載體,將轉(zhuǎn)錄因子E2F和NF k B的誘騙

3、性寡核苷酸運(yùn)送至冠脈局部,旨在評(píng)價(jià)其作為預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的生物制劑的潛在價(jià)值。
　　 [方法]
　　 1.采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)小型豬胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,EMSA法篩選與小型豬細(xì)胞具有特異性親和能力的誘騙性寡核苷酸序列,流式細(xì)胞儀及共聚焦掃描儀法篩選合適的體外轉(zhuǎn)染試劑,確定脂質(zhì)體為原代培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞的合適轉(zhuǎn)染載體。
　　 2.以陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000為寡核苷酸載體,預(yù)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的小型豬

4、胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測(cè)NFkB和E2F的誘騙性寡核苷酸對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)平滑肌細(xì)胞與增殖相關(guān)的蛋白PCNA和與凋亡相關(guān)的蛋白Caspase3表達(dá)的影響。
　　 3.采用RT-PCR及ELISA法檢測(cè)MMP-9及TIMP-1、MCP-1在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況,明確誘騙性寡核苷酸單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響。

5、>　　 4.建立小型豬冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄模型,與微創(chuàng)公司聯(lián)合研制誘騙性寡核苷酸-明膠涂層支架。造模4周后,取支架段血管切片,進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析,用掃描電鏡觀察血管內(nèi)皮修復(fù)情況,并用RT-PCR方法檢測(cè)局部血管組織中VEGF,NFkB,MCP-1,MMP-9,MMP-2,TIMP-1 mRNA表達(dá)水平,探討誘騙性寡核苷酸涂層支架預(yù)防再狹窄的分子機(jī)制。
　　 [結(jié)果]
　　 1.原代培養(yǎng)小型豬胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,E

6、MSA法確定轉(zhuǎn)錄因子NFkB和E2F-1誘騙性寡核苷酸序列,流式細(xì)胞儀及共聚焦掃描儀法表明Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。
　　 NFkB誘騙性寡核苷酸:5’AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3’,
　　 5’GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T3’。
　　 NFkB錯(cuò)配寡核苷酸:5’AGT TGA GGC CAC TAA

7、CCC AGG C3’,
　　 5’GCC TGG GTT AGT GGC CTC AAC T3’。
　　 E2F誘騙性寡核苷酸:5’CTA GAT TTC CCG CG3’,
　　 5’GAT CCG CGG GAA AT3’。
　　 E2F錯(cuò)配寡核苷酸:5’CTA GAT TTC GAG CG3’,
　　 5’GAT CCGCTC GAA AT3’。
　　 2.四甲基偶氮唑鹽法(MTT

8、)檢測(cè)結(jié)果表明:10％胎牛血清刺激24小時(shí)后,與正常對(duì)照組和相應(yīng)的錯(cuò)配寡核苷酸組比較,NFkB3誘騙性寡核苷酸組、E2F誘騙性寡核苷酸組和NFkB+E2F誘騙性寡核苷酸聯(lián)合組(半量聯(lián)合,1/2+1/2)均可明抑制平滑肌細(xì)胞增殖(34.96±6.35％,38.75±0.14％,49.60±5.07％),NFkB+E2F誘騙性寡核苷酸聯(lián)合組(1/2+1/2)抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)于兩種誘騙性寡核苷酸單獨(dú)應(yīng)用組,P值均小于0.01。10％

9、胎牛血清作用24小時(shí)后流式細(xì)胞儀分析表明:預(yù)轉(zhuǎn)染NFkB和/或E2F誘騙性寡核苷酸的平滑肌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加,S期和G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低；預(yù)轉(zhuǎn)染NFkB和/或E2F誘騙性寡核苷酸的平滑肌細(xì)胞早期凋亡百分率明顯增加。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:NFkB和E2F誘騙性寡核苷酸單獨(dú)作用組及其聯(lián)合作用組(1/2+1/2)其平滑肌細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平明顯降低,Caspase3蛋白表達(dá)水平明顯增加。
　　 3.RT-PCR實(shí)驗(yàn)

10、結(jié)果表明:在10％胎牛血清刺激12小時(shí)后,與正常對(duì)照組和錯(cuò)配寡核苷酸組比較,NFkB誘騙性寡核苷酸組和NFkB+E2F誘騙性寡核苷酸聯(lián)合作用組(1/2+1/2)MCP-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低；在10％胎牛血清刺激48小時(shí)后,與錯(cuò)配寡核苷酸對(duì)照組比較,NFkB誘騙性寡核苷酸組和NFkB+E2F誘騙性寡核苷酸聯(lián)合作用組(1/2+1/2)其MMP-9的mRNA表達(dá)水平明顯降低；E2F誘騙性寡核苷酸組無(wú)此變化。誘騙性寡核苷酸組和錯(cuò)配寡核苷

11、酸組其TIMP-1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。ELISA結(jié)果表明:10％胎牛血清刺激24小時(shí)后,預(yù)轉(zhuǎn)染NFkB誘騙性寡核苷酸的平滑肌細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　 4.小型豬冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后4周,病理形態(tài)學(xué)結(jié)果表明:與明膠涂層支架對(duì)照組比較,E2F誘騙性寡核苷酸涂層支架組新生內(nèi)膜面積、面積狹窄百分比及內(nèi)膜面積/中膜面積比值均明顯降低(1.28±0.72,0.38±0.20,0.40±0.12；4.04±0.82,

12、0.82±0.13,0.67±0.09)(P<0.05),NF k B誘騙性寡核苷酸涂層支架組和NF k B+E2F誘騙性寡核苷酸涂層支架(1/2+1/2)組與相應(yīng)的對(duì)照組比較上述指標(biāo)無(wú)明顯變化。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):NFkB和/或E2F誘騙性寡核苷酸涂層支架組其血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋面積明顯大于明膠涂層支架對(duì)照組。RT-PCR結(jié)果觀察到:與明膠涂層支架對(duì)照組比較,E2F誘騙性寡核苷酸涂層支架、NFkB誘騙性寡核苷酸涂層支架及NFkB+E2

13、F誘騙性寡核苷酸聯(lián)合涂層支架(1/2+1/2)其MMP-9 mRNA幾乎不表達(dá),而TIMP-1 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差別,其它如VEGF,NFkB,MCP-1 mRNA表達(dá)水平亦無(wú)明顯差別。
　　 [結(jié)論]
　　 1.對(duì)于原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)錄因子NF k B和E2F的誘騙性寡核苷酸單獨(dú)或聯(lián)合(1/2+1/2)應(yīng)用均可阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制細(xì)胞增殖,并且NF k B誘騙性寡核苷酸具有抑制炎癥因