HIV快速進(jìn)展者NK細(xì)胞microRNA表達(dá)譜全篩、驗(yàn)證及靶mRNA預(yù)測.pdf

1、目的：
　　人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune defiency syndrome，AIDS)即艾滋病的病原體。HIV感染后感染者的疾病進(jìn)程存在較大差異，研究影響HIV疾病進(jìn)程的因素及生物學(xué)標(biāo)志，將會對艾滋病治療、免疫調(diào)節(jié)和疫苗研究具有重要意義。
　　自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK cells

2、)是天然免疫系統(tǒng)的主要組成部分，對病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均發(fā)揮著重要的殺傷作用，其免疫應(yīng)答早于獲得性免疫，是機(jī)體的第一道防線。目前研究表明，HIV感染的疾病進(jìn)程取決于感染早期的免疫應(yīng)答情況[1]，因此，在感染早期就發(fā)揮作用的NK細(xì)胞越來越受到人們的關(guān)注。國際上的研究和我們課題組的報道亦證明，NK細(xì)胞的功能與HIV疾病進(jìn)程密切相關(guān)。
　　microRNA(miRNA，miR)是生物體內(nèi)源性的長度約為21-25個核苷酸的單鏈非編碼小R

3、NA，通過與靶mRNA形成完全或不完全互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)調(diào)控有重要影響。miRNA通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白和信號通路中的關(guān)鍵分子，進(jìn)而調(diào)控著細(xì)胞的發(fā)育和功能應(yīng)答。研究表明miRNA能夠調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的發(fā)育和功能應(yīng)答。在HIV感染過程中，NK細(xì)胞功能的變化是否受到miRNA的調(diào)控？HIV感染是否可引起某些miRNA的變化，進(jìn)而影響NK細(xì)胞的功能，導(dǎo)致HIV疾病進(jìn)程不同？目前HIV感染者miRNA研究主要集中在外周血單個核細(xì)胞(Pe

4、ripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，關(guān)于HIV感染者NK細(xì)胞miRNA的研究還未見報道。
　　本研究采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出HIV典型進(jìn)展者(typical progressors，TPs)、快速進(jìn)展者(rapid progressors，RPs)感染早期（120天）NK細(xì)胞以及健康對照者NK細(xì)胞，采用實(shí)時定量PCR技術(shù)進(jìn)行NK細(xì)胞miRNA表達(dá)譜(510種）全篩檢測及驗(yàn)證檢測，并對miR

5、NA靶mRNA進(jìn)行預(yù)測，以探索HIV感染對NK細(xì)胞miRNA的影響，以及miRNA水平對HIV疾病進(jìn)程的影響。
　　材料與方法：
　　1、研究對象
　　本研究選取37例未經(jīng)過高效抗病毒治療（High active antiretroviral therapy,HAART）的HIV早期感染者（early HIV infection，EHI），以及5例HIV血清抗體檢測陰性的健康者（HIV negative control

6、，HNC）。HIV早期感染的定義符合國際標(biāo)準(zhǔn)[20]。37例EHI被分到2組，即快速進(jìn)展者組（RP組）（感染一年后CD4+T細(xì)胞數(shù)量＜350 cells/μl）和典型進(jìn)展者組（TP組）(感染一年后CD4+T細(xì)胞數(shù)量≥500 cells/μl)。所有HIV感染者NK細(xì)胞miRNA采樣時間均為HIV感染120天。在miRNA全篩研究階段（miRNA training group），我們對5例RP，5例TP及5例HNC的NK細(xì)胞510種miR

7、NA進(jìn)行檢測。只有在RP組和TP組表達(dá)含量有明顯差異（即P＜0.05）的miRNA才能進(jìn)入miRNA驗(yàn)證檢測研究階段(miRNAvalidation group)。在miRNA驗(yàn)證研究階段，我們選取11例RP和16例TP進(jìn)行研究。37例HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診確診HIV感染的男男性接觸人群。5例HIV血清抗體檢測陰性的健康人，符合以下標(biāo)準(zhǔn):HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰

8、性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。所有研究對象都簽署了知情同意書。
　　2、CD4+T細(xì)胞絕對計數(shù)、NK細(xì)胞絕對計數(shù)
　　(1) CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)
　　應(yīng)用流式細(xì)胞儀FACSCalibur，MULTISET軟件檢測外周全血并進(jìn)行自動分析，計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對值及相應(yīng)比值。
　　(2) NK細(xì)胞絕對計數(shù)
　　應(yīng)用流式細(xì)胞儀FACSCalibur，MULTISET軟

9、件檢測外周全血并進(jìn)行自動分析，計算NK細(xì)胞絕對值及相應(yīng)比值。
　　3、病毒載量的檢測
　　采用Roche公司COBAS(R) AMPLICOR HIV-1 MONITORTM Test, Version1.5試劑盒在COBAS(R)TaqMan(R)系統(tǒng)進(jìn)行全自動PCR反應(yīng)體系制備及病毒載量檢測。
　　4、NK細(xì)胞分選及純度檢測
　　復(fù)蘇液氮凍存的PBMC樣本，離心400g，4℃，10分鐘。離心結(jié)束后棄上清，將復(fù)

10、蘇的PBMC轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)。用TriTEST CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP試劑進(jìn)行細(xì)胞表面染色，注意避光，4℃，30分鐘。染色結(jié)束，洗去未結(jié)合染料，加入3ml/管無菌PBS，離心350g，4℃，5分鐘。離心結(jié)束后棄上清，加入1.5ml無菌PBS，混勻細(xì)胞。PBMC樣本在流式細(xì)胞分選儀FACSAriaⅡ進(jìn)行分選，分選出NK細(xì)胞并進(jìn)行純度檢測。
　　5、NK細(xì)胞miRNA表達(dá)量的檢測
　　(1)總

11、RNA的分離
　　用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞并計數(shù)，300g離心10min收集細(xì)胞樣本;小心吸取出PBS后，加入650μl Lysis Buffer;渦旋振蕩使細(xì)胞完全裂解。按照細(xì)胞與組織TotalRNA提取試劑操作說明書標(biāo)準(zhǔn)方法提取總RNA。
　　(2) miRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA
　　首先在miRNA的3'尾部添加Poly A(A-Plus)，然后cDNA鏈的合成(RT-PCR)。全部操作按照Quanto-miR c

12、DNA合成試劑操作說明書的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
　　(3) qPCR反應(yīng)
　　miRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)。全部特異性引物均來自microRNAprimer system（北京曠博生物技術(shù)有限公司，中國）。全部操作按照Quanto-miR檢測試劑說明書進(jìn)行，采用2-△△CT方法，檢測miRNA的表達(dá)水平。
　　6、靶mRNA預(yù)測及Pathway enrichment分析
　　用miRecords（htt

13、p://mirecords.biolead.org/）進(jìn)行miRNA的靶mRNA基因預(yù)測。從結(jié)果中選擇至少有3種算法能共同預(yù)測出的靶基因。然后將這些靶基因通過GeneGO MetacoreTM軟件進(jìn)行Pathway enrichment分析，設(shè)置P＜0.05。
　　7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　用SPSS17.0統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。TP組，RP組及HNC組各組患者的基本信息、免疫學(xué)指標(biāo)及病毒載

14、量的比較，分類變量采用卡方檢驗(yàn)，連續(xù)型變量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非參數(shù)變量采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。miRNA的表達(dá)水平與免疫學(xué)指標(biāo)和病毒載量間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。不同組間miRNA表達(dá)水平的差異用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析。HIV感染者的血漿病毒載量用自然對數(shù)(log10)表示。受試者工作特征曲線(Receiveroperating characteristic curve，ROC curv

15、e)用來評價NK細(xì)胞miRNA表達(dá)水平預(yù)測疾病進(jìn)程的診斷價值。Kaplan-Meier生存分析來分析感染早期NK內(nèi)miRNA表達(dá)不同高低水平患者的生存情況。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、HIV感染者的基本情況
　　HIV感染者CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)、NK細(xì)胞絕對數(shù)及百分比均低于健康對照者。通過Loess曲線擬合觀察到快速進(jìn)展者CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)及NK細(xì)胞絕對數(shù)持續(xù)高于典型進(jìn)展者，病毒載量持續(xù)低

16、于典型進(jìn)展者。
　　二、NK細(xì)胞分選純度及總R隊(duì)質(zhì)量評估
　　所有研究對象NK細(xì)胞分選純度均在99％以上。從RNA濃度、A260/A280以及qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)來看，所有樣本的RNA都成功提取，且cDNA質(zhì)量也均通過質(zhì)控。
　　三、HIV感染者NK細(xì)胞miRNA全篩結(jié)果
　　1、HIV感染者(HIV組)和健康對照者(HNC組)NK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)
　　與HNC組相比，HIV組NK細(xì)胞miRNA大多數(shù)表達(dá)

17、含量下降，有41種miRNA相對含量顯著下降，6種miRNA相對含量顯著升高（P＜0.05）。
　　2、TP組與HNC組NK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)
　　與HNC組相比，TP組有14種miRNA相對含量顯著下降，6種miRNA相對含量顯著升高(P＜0.05)。
　　3、RP組與HNC組NK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)
　　與HNC組相比，RP組有71種miRNA相對含量顯著下降，12種miRNA相對含量顯著升高（P＜0.

18、05）。
　　4、TP組和RP組NK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)
　　與TP組相比，RP組NK細(xì)胞有30種miRNA相對含量顯著下降，有12種miRNA相對含量顯著升高(P＜0.05)。共計有顯著差異變化的miRNA42種。
　　四、HIV感染者NK細(xì)胞miRNA驗(yàn)證研究結(jié)果
　　1、TP組與RP組驗(yàn)證研究結(jié)果
　　擴(kuò)大樣本（TP組11例，RP組16例），對篩選到的影響HIV疾病進(jìn)程的42種miRNA進(jìn)行驗(yàn)證檢測

19、。結(jié)果顯示:miR-302d相對含量在RP組顯著升高(P=0.00058)。
　　2、miR-302d的相對含量與CD4、病毒載量的相關(guān)性分析
　　miR-302d相對含量與患者感染早期（120天）、感染1年后CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)均呈顯著負(fù)相關(guān)性（P=0.0008，r=-0.6087; P=0.0002，r=-0.6656），但是與病毒載量無相關(guān)性。
　　3、ROC曲線分析miR-302d相對含量對HIV疾病快速進(jìn)展的

20、預(yù)測作用
　　ROC曲線分析顯示，HIV感染早期NK細(xì)胞miR-302d的相對含量對預(yù)測HIV疾病快速進(jìn)展有高準(zhǔn)確性（P=0.00046，AUC=0.903）。
　　4、miR-302d相對含量不同的HIV感染者疾病進(jìn)展的生存分析
　　將CD4+T細(xì)胞絕對數(shù)＜350cells/μl，病毒載量＞104.5copies/ml作為結(jié)局事件，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，我們發(fā)現(xiàn):miR-302d相對含量高的HIV感染

21、者(“≥median”組)CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降速率快(P=0.0002，log-rank x2=13.68)，病毒載量的下降速率無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5、miR-302d相對表達(dá)量與NK細(xì)胞數(shù)量分析
　　miR-302d相對含量與HIV感染早期（120天）、感染1年后NK細(xì)胞數(shù)量及百分比均無相關(guān)性。提示miR-302d是通過影響NK細(xì)胞功能，進(jìn)而影響HIV疾病進(jìn)程。
　　五、miR-302d靶mRNA預(yù)測分析結(jié)果

22、>　　通過軟件分析，預(yù)測了miR-302d靶mRNA基因，其主要在WNT signalingpathway， FAS signaling cascades，Granzyme B signaling pathway等信號通路中富集。推測在HIV早期感染時，miR-302d可能抑制發(fā)揮殺傷功能的mRNA表達(dá)，使殺傷功能下降，進(jìn)而影響隨后的疾病進(jìn)程。
　　結(jié)論：
　　1、通過miRNA全篩研究發(fā)現(xiàn)，與典型進(jìn)展者相比，快速進(jìn)展者有3