雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，目前胃癌的發(fā)病率雖呈下降的趨勢(shì)，但其預(yù)后情況仍不容樂(lè)觀，全球范圍內(nèi)的五年生存率仍低于24％。對(duì)于局部進(jìn)展期和晚期胃癌來(lái)講，化療仍是治療的主要手段。多年來(lái)胃癌的化療似乎進(jìn)入“瓶頸”階段，目前氟尿嘧啶類(lèi)和鉑類(lèi)藥物仍然是胃癌化療的基礎(chǔ)，聯(lián)合蒽環(huán)類(lèi)還是紫杉類(lèi)尚有爭(zhēng)議，因此為降低胃癌死亡率或延長(zhǎng)胃癌患者生存期，探索低毒、有效的拮抗胃癌的新藥是當(dāng)前研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。
　　雙膦酸鹽類(lèi)藥物一

2、般用于治療各種原因所致的骨吸收性疾病。目前臨床前研究表明，雙膦酸鹽類(lèi)藥物具有直接及間接抗腫瘤作用;臨床研究則證實(shí)伴有骨轉(zhuǎn)移的腫瘤病人應(yīng)用雙膦酸鹽，可使病人從中明顯獲益。在對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽類(lèi)藥物確實(shí)具有直接抗腫瘤效應(yīng)，其主要是通過(guò)抑制腫瘤增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用的。以往的研究表明，由于結(jié)構(gòu)上的不同，不同的雙膦酸鹽類(lèi)藥物的抗腫瘤效應(yīng)亦不相同。在體外，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用強(qiáng)度是由其

3、側(cè)鏈基團(tuán)所決定的，其R2側(cè)鏈越為復(fù)雜，則其抗腫瘤效應(yīng)越強(qiáng)。但有關(guān)雙膦酸鹽類(lèi)藥物抗腫瘤的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑目前不完全清楚，且其對(duì)胃癌的抗腫瘤研究少見(jiàn)報(bào)道。
　　細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signalregulated kinase1/2，ERK1/2)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員。

4、ERK1/2信號(hào)通路被激活后，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的底物蛋白或轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，引起底物蛋白活化和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殪、分化、凋亡等。以往的研究表明，ERK1/2信號(hào)通路可以通過(guò)線(xiàn)粒體及死亡受體細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮對(duì)凋亡的調(diào)控作用。ERK1/2信號(hào)通路參與多種藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其亦有可能參與雙膦酸鹽類(lèi)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，有關(guān)ERK1/2信號(hào)通路是否參與雙膦酸鹽類(lèi)藥物誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)新合成的雙膦

5、酸鹽類(lèi)藥物CP進(jìn)行研究，其化學(xué)名稱(chēng)為[2-（6-氨基-嘌呤-9-基）-1-羥基-膦酰乙基]膦酸，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，除了含氮之外，其R2側(cè)鏈增加了腺嘌呤，結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜（見(jiàn)Fig.1.1）。在體外，應(yīng)用CP對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行干預(yù);并構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤，應(yīng)用CP進(jìn)行體內(nèi)研究，分析ERK1/2信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，以探討ERK1/2信號(hào)通路與雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP抗胃癌作用間的關(guān)系，揭示其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為雙膦酸鹽

6、類(lèi)藥物在胃癌化學(xué)治療中提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究。
　　培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株(SGC-7901、BGC-823、MKN-45和MKN-28)和人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Lovo、HT-29)以不同濃度的CP（20，40，80，160μmol/L）作用于細(xì)胞，采用MTT法觀察CP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并計(jì)算CP的半數(shù)抑制濃度(IC50)。對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行藥物CP干

7、預(yù)實(shí)驗(yàn)，MTT法觀察不同作用時(shí)間點(diǎn)（0、1、3、6、12和24h），不同藥物濃度(10、20、40和80μmol/L)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)CP對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響，酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞凋亡的DNA片斷，Westem blot檢測(cè)CP對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步凋亡酶活性分析CP作

8、用后caspase-3、caspase-9活性的變化，觀察CP在體外抑制胃癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡中的作用。
　　2、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)胃癌細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路影響的研究。
　　應(yīng)用40μmol/L的CP對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，Western blot檢測(cè)CP作用不同時(shí)間（0、0.5、1、3、6、12和24h），細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、MEK、p-MEK、R

9、af-1、p-Raf-1蛋白的表達(dá)水平。RT-PCR法檢測(cè)ERK1/2 mRNA水平。應(yīng)用ERK1/2通路抑制劑PD98059及ERK1/2干擾RNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為8組:CP(40μmol/L)組;PD98059（20μmol/L）組;CP（40μmol/L）+PD98059(20μmol/L)組;ERK1/2 siRNA(25nmol/L)組;control siRNA(25nmol/L)組;CP(40μmol/L)+

10、control siRNA(25nmol/L)組;CP（40μmol/L）+ERK1/2 siRNA（25nmol/L）組;對(duì)照組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力;FCM檢測(cè)各組sub-G1期細(xì)胞百分比;凋亡酶活性分析，測(cè)定各組caspase-9活性;western blot分析各組PARP、cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。最終探討ERK1/2通路與CP抑制胃癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡之間的關(guān)系。

11、　　3、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究。
　　將人胃癌SGC-7901細(xì)胞接種于12只BABL/C/nu/nu裸鼠（4周齡，雌性，15-17g）左側(cè)腋窩皮下（細(xì)胞數(shù)2×106/部位），構(gòu)建胃癌裸鼠移植瘤模型，將裸鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組及CP組，每組6只。接種后第5天開(kāi)始，每日腹腔注射0.16％碳酸氫鈉溶液及CP(200μg/kg/day，濃度為1mmol/L)至第30天，每周秤量裸鼠體重2次，每3天測(cè)量移

12、植瘤的最長(zhǎng)徑及最短徑，計(jì)算腫瘤體積并同時(shí)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，體積按公式V=ab2/2計(jì)算（a，b分別為腫瘤的最長(zhǎng)徑、最短徑）。第30天處死裸鼠，取瘤體及裸鼠臟器，秤瘤重。免疫組織化學(xué)檢測(cè)PCNA及Ki67在移植瘤中的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)裸鼠移植瘤中細(xì)胞凋亡情況，Western blot ECL法檢測(cè)移植瘤ERK1/2、pERK1/2、JNK、pJNK、p38、p-p38蛋白表達(dá)變化，HE染色后，光鏡下觀察移植瘤及裸鼠肝、腎臟器的改變。<

13、br>　　結(jié)果:
　　1、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究。
　　1.1 MTT法測(cè)定胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。用MTT法觀察CP對(duì)胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，計(jì)算CP的半數(shù)抑制濃度為40μmol/L。用10～80μmol/LCP作用于胃癌SGC-7901、MKN-28、BGC-823細(xì)胞株1、3、6、12和24h后，可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性，CP作用后對(duì)胃癌正常粘膜細(xì)胞GES-1無(wú)抑制作用。
　

14、　1.2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。40μmol/L CP作用0、6、12、24h后能誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，在流式DNA組方圖上表現(xiàn)為亞G1峰的出現(xiàn)，其出現(xiàn)于G0/G1峰前，此峰代表細(xì)胞凋亡。并呈時(shí)間依賴(lài)性改變細(xì)胞周期的分布，使G1期細(xì)胞、S期細(xì)胞比例降低,sub-G1期、G2/M期細(xì)胞比例增高。AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:隨時(shí)間延長(zhǎng)，AnnexinⅤ陽(yáng)性/PI陰性細(xì)胞逐漸增多，具有時(shí)效關(guān)系。<

15、br>　　1.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的DNA片斷。40μmol/L CP作用胃癌SGC-7901細(xì)胞0、6、12、24h后，酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞的DNA片段。隨著CP作用時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)DNA片段逐漸增多，反映凋亡細(xì)胞逐漸增多。
　　1.4 CP對(duì)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad、caspase-3、-9、PARP蛋白表達(dá)的影響。40μmol/L CP作用SGC-7901細(xì)胞0、6、12和24h后

16、，cleavedcaspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP、Bax、Bad表達(dá)水平逐漸升高，而B(niǎo)cl-2蛋白水平逐漸下降，差異有顯著性(P＜0.05);Bax/Bcl-2比率逐漸升高。
　　1.5凋亡酶活性分析。胃癌SGC-7901細(xì)胞在40μmol/L CP作用0、6、12、24h后，caspase-3、caspase-9的活性呈時(shí)間依賴(lài)性的增高，(P＜0.05)
　　2、雙膦酸鹽類(lèi)藥

17、物CP對(duì)胃癌細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路影響的研究。
　　2.1 CP上調(diào)胃癌細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。40μmol/L的CP作用胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、3、6、12、24h)，可見(jiàn)p-ERK1/2蛋白表達(dá)逐漸增高，其上游相關(guān)蛋白p-raf-1，p-MEK1/2蛋白表達(dá)亦逐漸增高，而MAPK其他兩條p38及JNK蛋白表達(dá)無(wú)變化。40μmol/L的CP作用胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、

18、12、24h)，可見(jiàn)ERK1/2 mRNA水平逐漸增高。
　　2.2 PD98059、ERK1/2 siRNA減弱了CP抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。CP、PD98059及ERK1/2 siRNA單獨(dú)或兩者聯(lián)合作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，經(jīng)MTT分析，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）組和CP（40μmol/L）+ERK1/2 siRNA(25nmol/L)組的細(xì)胞活力較單獨(dú)應(yīng)用CP（40μmol/

19、L）組增強(qiáng)，可見(jiàn)PD98059及ERK1/2 siRNA削弱了CP抑制胃癌細(xì)胞增殖作用。
　　2.3 PD98059、ERK1/2 siRNA抑制了CP誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用
　　流式細(xì)胞術(shù)分析CP處理后的亞二倍體峰期（sub-G1期）胃癌細(xì)胞的百分比發(fā)現(xiàn)，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）組和CP(40μmol/L)+ ERK1/2 siRNA(25nmol/L)組的sub-G1細(xì)胞占比較單獨(dú)應(yīng)用

20、CP(40μmol/L)組明顯降低，說(shuō)明PD98059和ERK1/2 siRNA均抑制了CP誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　2.4 CP、PD98059、ERK1/2 siRNA對(duì)caspase-9活性及PARP表達(dá)的影響。凋亡酶caspase-9活性分析顯示，CP（40μmol/L）+PD98059（20μmol/L）組和CP(40μmol/L)+ERK1/2 siRNA(25nmol/L)組的caspase-9活性較CP（40μ

21、mol/L）組顯著降低。同時(shí)western blot分析PARP蛋白表達(dá)，PD98059和ERK1/2 siRNA均降低了CP誘導(dǎo)的cleaved PARP蛋白表達(dá)水平。
　　2.5 CP、PD98059、ERK1/2 siRNA對(duì)ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。CP(40μmol/L)、PD98059(20μmol/L及ERK1/2 siRNA(25nmol/L)單獨(dú)或兩者聯(lián)合作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，可見(jiàn)PD9805

22、9及ERK1/2siRNA部分的抑制了CP對(duì)ERK1/2的激活。
　　3、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究。
　　在裸鼠的皮下，應(yīng)用胃癌SGC-7901細(xì)胞，成功構(gòu)建出人胃癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率達(dá)100％。和對(duì)照組相比，CP組移植瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，CP處理組裸鼠移植瘤第9、15、21、27、30天的平均體積分別為51±10.17mm3、254.17±38.78mm3

23、、358.33±43.89mm3、462.5±52.22mm3及595±55.76mm3，對(duì)照組的相應(yīng)平均體積分別為119.83±8.35mm3、299.66±30.81 mm3、646.33±47.50mm3、1101.57±60.47mm3及1298.33±66.16mm3，CP處理組的裸鼠移植瘤瘤體的平均瘤重為0.67±0.09g，顯著低于對(duì)照組的1.10±0.16g(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)，CP組PCNA和Ki-67在

24、移植瘤組織中的表達(dá)，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05）。TUNEL檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，CP組移植瘤的凋亡率增加，兩者有顯著性差異(P＜0.05)。CP移植瘤組pERK1/2的表達(dá)水平較對(duì)照組升高，JNK、pJNK、p38、p-p38蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變。光鏡下觀察兩組裸鼠肝、腎也無(wú)藥物性損害改變。
　　結(jié)論:
　　1、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性的抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。
　　2、雙膦酸鹽類(lèi)

25、藥物CP可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖。
　　3、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP處理可激活ERK1/2信號(hào)通路，ERK1/2的磷酸化蛋白表達(dá)增高。
　　4、ERK1/2抑制劑PD98059及ERK1/2 siRNA下調(diào)CP抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡作用。
　　5、雙膦酸鹽類(lèi)藥物CP可在體內(nèi)、體外