胎盤細(xì)胞凋亡在感染HBV的PBMC轉(zhuǎn)運(yùn)中作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 ①在體外建立共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。②胎盤細(xì)胞凋亡在感染HBV的PBMCs轉(zhuǎn)運(yùn)中作用。
　　 方法:
　　 ①本次實(shí)驗(yàn)采用100μlHBVDNA含量為5x106copies/ml的病人血清感染PBMC，用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同共培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)12h、24h、48h和72h細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。將共培養(yǎng)的細(xì)胞清洗4次，用FQ-PCR法檢測(cè)PBMC和洗液中的HBVDNA的含量。
　　 ②在1

2、μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)Transwell小室上室感染HBV的PBMC與BeWo的融合現(xiàn)象。以8μm孔徑Transwell小室共培養(yǎng)模型中，用流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測(cè)下室中是否出現(xiàn)標(biāo)有綠色熒光的PBMC。
　　 ③本次實(shí)驗(yàn)將共培養(yǎng)模型設(shè)立三個(gè)組：正常對(duì)照組、HBV與BeWo共培養(yǎng)組、HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h后分別收集各組細(xì)胞通過

3、FACS檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。
　　 ④用RT-PCR法檢測(cè)HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同時(shí)間點(diǎn)0h、12h、24h、48h，BeWo細(xì)胞的Caspase3mRNA的表達(dá)情況。
　　 ⑤用FQ-PCR法檢測(cè)HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組下室中的PBMC的HBVDNA和HBVcccDNA含量。
　　 結(jié)果:
　　 ①5×106copies/ml的HBV陽性血清刺激PBMC，共培養(yǎng)12h、24h和4

4、8hPBMC的細(xì)胞數(shù)不斷增加，共培養(yǎng)72h左右，細(xì)胞數(shù)會(huì)減少。與HBV血清共培養(yǎng)48h的PBMC檢測(cè)出HBVDNA，提示發(fā)生感染，而清洗細(xì)胞的洗液中未檢測(cè)出HBVDNA。
　　 ②在1μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng)模型中BeWo細(xì)胞被染上了綠色熒光提示HBV+PBMC與BeWo發(fā)生了融合。以8μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，下室中檢測(cè)到標(biāo)有綠色熒光的PBMC，證明在Transwell小室共培養(yǎng)感染HBV的PBM

5、C與BeWo細(xì)胞模擬胎盤屏障的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)模型構(gòu)建成功。
　　 ③BeWo與HBV血清和HBV+PBMC共培養(yǎng)0h、12h、24h、48h，HBV感染組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組的早期凋亡率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為0.027、1.824、7.186、7.749，P值均大于0.05)。在共培養(yǎng)Oh、12h，HBV感染組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組，BeWo總凋亡率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為2.922、1.3

6、56，P值均大于0.05）；但是共培養(yǎng)24h、48h，HBV感染組總凋亡率與同期的對(duì)照組和HBV+PBMC共培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為15.678、14.892，P值均小于0.05）。分別對(duì)同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的早期凋亡率及總凋亡率進(jìn)行比較，各組中不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率不同，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，到48h時(shí)HBV感染組總凋亡率為（68.90±0.33）％達(dá)到最高。不同時(shí)間點(diǎn)早期凋亡率的比較，除了對(duì)照組其它各組

7、的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為3.968、31.648、31.941，對(duì)照組P值大于0.05，其他各組P值均小于0.05)，且不同時(shí)間點(diǎn)總凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為82.827、29.292、63.951，P值均小于0.05)。
　　 ④HBV+PBMC與BeWo共培養(yǎng)組不同的時(shí)間點(diǎn)BeWo細(xì)胞Caspase3mRNA的表達(dá)量相比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.114，P=0.002)，且各組間兩兩比較后，除12h與O

8、h外，Caspase3mRNA的相對(duì)表達(dá)量相比無差異外，其他各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在24h和48h組中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)Caspase3mRNA的相對(duì)表達(dá)量有升高的趨勢(shì)。
　　 ⑤在BeWo細(xì)胞和HBV+PBMC共培養(yǎng)組中，BeWo細(xì)胞早期凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.908，p=0.002)，BeWo細(xì)胞總凋亡率與PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.969，p=0.001)。BeWo細(xì)胞Caspase3mRNA

9、相對(duì)表達(dá)量和PBMC遷移率呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.950，p=0.00l)。
　　 ⑥HBV+PBMC與BeWo細(xì)胞共培養(yǎng)24h和48h時(shí)，下室的PBMCHBVDNA拷貝數(shù)分別為(1.925±0.43l)x103copies/ml、(2.565±0.36l)x103copies/ml，同時(shí)，在此時(shí)間點(diǎn)HBVcccDNA的拷貝數(shù)分別為(7.560±1.513)x102copies/ml、(1.3550±2.473)x103copie

10、s/ml，按判斷標(biāo)準(zhǔn)HBVDNA拷貝數(shù)≥103copies/ml為陽性，提示此時(shí)間點(diǎn)下室中的PBMC發(fā)生感染，且按判斷標(biāo)準(zhǔn)HBVcccDNA拷貝數(shù)≥5X102copies/ml為陽性，提示HBV發(fā)生復(fù)制。
　　 結(jié)論:
　　 ①乙型肝炎病毒能夠在PBMC中復(fù)制，并在體外成功構(gòu)建BeWo細(xì)胞與感染HBV的PBMC共培養(yǎng)模型模擬胎盤屏障的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 ②胎盤細(xì)胞凋亡率與PBMC的遷移率的正相關(guān)關(guān)系，提示凋亡可能