體外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用.pdf

1、目的:
　　研究miR-155在HBV慢性感染的細(xì)胞模型中對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)及其抗HBV作用。
　　方法:
　　1.提取人肝癌細(xì)胞株總DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增miR-155前體序列，酶切后退火連接到pmR-mCherry質(zhì)粒，構(gòu)建pmiR-155真核表達(dá)載體，然后進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切和DNA測(cè)序鑒定。
　　2.利用脂質(zhì)體法將pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載組（pmR

2、-mCherry質(zhì)粒）、轉(zhuǎn)染試劑組、空白組和對(duì)照組（HepG2細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光蛋白的表達(dá)情況，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)量。
　　3.重組質(zhì)粒pmiR-155經(jīng)去內(nèi)毒素提取后，轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞株。收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組SOCS-1 mRNA的變化，Western Blot檢測(cè)各組SOCS-1蛋白的變化，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞的IFN-

3、γ及IL-2的分泌量變化。
　　4.重組質(zhì)粒pmiR-155轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載組(pmR-mCherry質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染試劑組、空白組。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)量，化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBsAg和HBeAg變化，熒光實(shí)時(shí)定量PCR定量檢測(cè)HBV DNA拷貝數(shù)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切及DNA測(cè)序鑒定

4、，證實(shí)miR-155前體序列成功插入pmR-mcherry真核表達(dá)載體，pmiR-155真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察，載體中紅色熒光蛋白有較好的表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到50％以上。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，以空白組為基準(zhǔn)，重組載體組細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的miR-155明顯增加，具有顯著意義(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR結(jié)果示:重組載體組SOCS-1 mRNA的表達(dá)量(0.63

5、±0.09)顯著低于空白組(P＜0.05);Western Blot結(jié)果示:重組載體組內(nèi)SOCS-1蛋白表達(dá)量(0.37±0.07)顯著低于空白組(P＜0.05);ELISA結(jié)果示:以空白組為基準(zhǔn)，重組載體組與對(duì)照組所分泌的IFN-γ、IL-2水平均顯著高于空白組(P＜0.05)，而空載組及轉(zhuǎn)染試劑組與空白組相似。
　　4.化學(xué)發(fā)光法結(jié)果示:以空白組為基準(zhǔn)，轉(zhuǎn)染后重組載體組細(xì)胞所分泌HBsAg、HBeAg明顯減少，而空載組及轉(zhuǎn)染試

6、劑組與空白組相似。轉(zhuǎn)染后48h重組載體細(xì)胞內(nèi)miR-155對(duì)HBsAg和HBeAg抑制最為明顯，抑制率分別為(83.96±1.52)％和(79.60±8.71)％。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果示:轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，以空白組為基準(zhǔn)，重組載體組中HBV DNA拷貝數(shù)明顯減少，而空載組及轉(zhuǎn)染試劑組未見(jiàn)明顯差異。其中重組載體組內(nèi)miR-155對(duì)HBV DNA的抑制率分別為(51.87±0.36)％、(43.67±1.51)％和(68.