泰安地區(qū)慢性感染HBV RT區(qū)耐藥性分子變異及其體外表達.pdf

1、目的：通過對臨診乙型肝炎病毒(Hepatisis B Virus，HBV)感染陽性患者所攜帶HBV基因組DNA(Genomic DNA，gDNA)的反轉錄酶(Reverse Transcriptase，RT)區(qū)進行調(diào)查，以期發(fā)現(xiàn)單個或多個有義變異位點，從而推斷其變異與抗HBV藥物的相關性，為發(fā)現(xiàn)HBV新的耐藥位點及臨床抗HBV用藥提供新的素材和理論參考；選取典型變異樣本的HBV gDNA，構建其RT活性區(qū)的重組克隆，轉染細胞并經(jīng)間接免疫

2、熒光(indirect immunofluorescence assay，IFA)檢測其表達活性，為構建其永久表達細胞系做準備，同時為研究HBV變異與耐藥性奠定基礎。
　　 方法：⑴選取從2011年4月至2011年12月在泰安八十八醫(yī)院用核苷(酸)類藥物治療的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)大三陽患者，取其全血并分離血清，-80℃標記凍存。⑵采用BIOMIGA公司血液基因組DNA提取試劑盒從保存的血

3、清中分離、純化HBV gDNA。⑶取經(jīng)PCR擴增HBV S基因片段為陽性的核酸樣本，用互為重疊的兩對引物經(jīng)PCR分兩段擴增HBV DNA全長基因(分為f1、f2兩部分)。⑷將擴增出的f1、f2片段PCR產(chǎn)物分別與原核載體pMD18 T vecter連接，分別命名為T-f1、T-f2，在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落，經(jīng)初步特異性檢測為陽性的克隆菌落后測序，并對測序結果進行拼接，比對，校正，分析HBV基因核苷酸差異、變異類型。⑸選取一例H

4、BV RT區(qū)發(fā)生經(jīng)典變異的樣本，并以該樣本T-f1、T-f2為模板，設計含有EcoR I和BamH I酶切位點的引物，擴增回收RT片段，與克隆載體pMD18 Tsimple vecter連接，測序驗證后，將RT片段酶切回收，亞克隆入pcDNA3.1(-)中，構建真核表達重組質粒pc-RT。⑹用200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml6個新霉素濃度梯度作用于CHO細胞，鏡

5、下觀察選擇出在10-14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低新霉素濃度。⑺將重組質粒pc-RT在陽性脂質體的介導下轉染CHO細胞，6小時后加入帶有新霉素篩選濃度的培養(yǎng)液，24小時后檢測RT區(qū)在CHO細胞中的表達。⑻對轉染的細胞用大三陽陽性血清介導的IFA和Western blot檢測HBV RT區(qū)蛋白的表達。
　　 結果：①在P區(qū)基因的反轉錄酶區(qū)，有幾處需關注的變異情況(兩例及以上出現(xiàn)的變異)，可能為引起CHB患者耐藥變異的位點。②經(jīng)濃度梯

6、度遞倍稀釋等篩選，最后確定CHO細胞對新霉素的最佳篩選濃度為700ug/ml。③IFA實驗結果顯示，在熒光顯微鏡下，陽性表達細胞在70％以上。Western Blot實驗結果顯示，HBV RT區(qū)蛋白在CHO細胞中成功表達。
　　 結論：⑴上述慢性乙型肝炎患者應用核苷(酸)類藥物治療過程中，P區(qū)出現(xiàn)幾處需關注的變異情況，有5例樣本與已報道的HBV RT區(qū)經(jīng)典變異位點相同，有6處氨基酸變異與已證實的位點有所不同，初步發(fā)現(xiàn)了與HBV耐