Tim-3在HBV慢性感染中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染肝細(xì)胞引發(fā)一系列的肝臟炎癥性疾病，嚴(yán)重影響人類的健康。已有研究證實(shí)，HBV感染所致多種淋巴細(xì)胞功能失調(diào)不僅是乙肝患者持續(xù)感染的重要機(jī)制之一，而且在乙肝患者不同的預(yù)后、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著不容忽視、甚至是決定性的作用。但HBV所致的免疫失調(diào)的具體機(jī)制尚未完全明確。 眾多研究表明，多種免疫調(diào)節(jié)分子在HBV感染所致淋巴細(xì)胞功能失調(diào)中發(fā)揮著重要作用。Tim-3（T cell immu

2、noglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3，Tim-3）是在2002年被發(fā)現(xiàn)的，特異性表達(dá)在分化終末期的Th1細(xì)胞上的新型免疫調(diào)節(jié)分子。Tim-3與其配體之一-galectin-9相互作用可負(fù)向調(diào)控IFN-γ的產(chǎn)生，并可影響T細(xì)胞耐受的形成。近來(lái)的研究結(jié)果顯示，Tim-3除了在Th1細(xì)胞上表達(dá)外，在細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc1細(xì)胞）、樹(shù)突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞上均有表達(dá)，并且通過(guò)影響這些細(xì)胞的

3、功能，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Tim-3mRNA在慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)升高，提示Tim-3很可能在HBV慢性感染中發(fā)揮著重要的作用。本課題利用臨床研究、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究Tim-3在慢乙肝發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)及功能，為進(jìn)一步深入闡明HBV感染相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1. Tim-3在慢乙肝患者體內(nèi)的表達(dá) 1.1 Tim-3在慢乙肝患者體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞

4、亞群中的表達(dá) 收集慢乙肝患者、健康志愿者和脂肪肝患者新鮮外周肝素抗凝血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tim-3在外周血不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)。收集慢乙肝患者和脂肪肝患者肝組織，免疫組化檢測(cè)Tim-3在肝臟中的表達(dá)。 1.2慢乙肝患者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá)與血清ALT水平，HBVDNA等的相關(guān)性分析 利用Prism GraphPad軟件對(duì)慢乙肝患者外周血不同淋巴細(xì)胞亞群上Tim-3的表達(dá)與患者血清ALT水平

5、，HBV DNA量進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。 2.HBV感染對(duì)Tim-3表達(dá)的影響 2.1以人NK92細(xì)胞系為研究對(duì)象體外模擬研究HBV感染對(duì)Tim-3表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人NK細(xì)胞系NK92細(xì)胞，利用電穿孔轉(zhuǎn)染法將HBV表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-1.1HBV轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，以含200μg/mL G418的培養(yǎng)基穩(wěn)篩1～2周。同時(shí)以轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體的NK92細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞。利用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢

6、測(cè)Tim-3的表達(dá)。 2.2以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為研究模型研究HBV感染對(duì)Tim-3表達(dá)的影響 利用Percoll分離液密度梯度離心法分離HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞，并以正常Balb/c小鼠作為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)。 3.Tim-3對(duì)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞功能影響的研究 3.1 Tim-3對(duì)NK細(xì)胞功能影響的研究 3.1.1阻斷Tim-3對(duì)NK92功能

7、的影響 以NK92細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，給予Tim-3抗體/Tim-3-Fc融合蛋白、同型抗體或PBS緩沖液作用后，按不同效靶比（1：1、5：1和25：1）與人肝癌細(xì)胞系HepG2或HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行共孵育4小時(shí)， CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞殺傷效率，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ分泌。 3.1.2阻斷Tim-3對(duì)慢乙肝患者外周血淋巴細(xì)胞殺傷功能的影響 分離慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，給予Ti

8、m-3抗體、同型抗體或PBS緩沖液后，研究效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞HepG2或HepG2.2.15細(xì)胞的殺傷效率和IFN-γ分泌。 3.2 Tim-3對(duì)肝炎模型小鼠肝臟CD8+T細(xì)胞功能影響的研究 3.2.1制備小鼠HBV肝炎模型 利用尾靜脈高壓注射法將HBV表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-1.1HBV注入小鼠體內(nèi)制備小鼠HBV肝炎模型，同時(shí)以pcDNA3質(zhì)粒制備小鼠模型對(duì)照。在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，實(shí)時(shí)免疫熒光檢測(cè)（IFMA）試

9、劑盒檢測(cè)小鼠血清中表面抗原、表面抗體和e抗原的水平，免疫組化檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)HBc的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血清中HBV DNA的水平。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。 3.2.2 Tim-3在模型小鼠肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá) 分離模型小鼠和對(duì)照小鼠肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tim-3在肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá)。 3.2.3構(gòu)建特異針對(duì)Tim-3的shRNA表達(dá)載體 設(shè)計(jì)并

10、合成針對(duì)Tim-3或無(wú)關(guān)序列的shRNA寡核苷酸，退火后與shRNA表達(dá)載體pmU6相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切、DNA測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組子，并被分別命名為T(mén)im-3 shRNA-1，Tim-3 shRNA-2和unshRNA。 3.2.4體外驗(yàn)證Tim-3 shRNA表達(dá)載體的抑制效果 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，24、48和72小時(shí)后收集

11、細(xì)胞，RT-PCR和western blot檢測(cè)Tim-3和β-actin表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)Tim家族另一成員-Tim-1的表達(dá)以驗(yàn)證Tim-3 shRNA抑制效果的特異性。 3.2.5 shRNA抑制Tim-3表達(dá)對(duì)小鼠肝炎模型肝臟內(nèi)CD8+T細(xì)胞功能的影響 利用尾靜脈高壓注射法將pcDNA3-1.1HBV與Tim-3 shRNA或unshRNA表達(dá)載體注入小鼠體內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平以

12、驗(yàn)證Tim-3 shRNA的體內(nèi)抑制效果，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)研究Tim-3被抑制后對(duì)細(xì)胞功能的影響。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism4軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis非參數(shù)H檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析。p<0.05或p<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1. Tim-3在慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá)升

13、高 1.1 Tim-3在慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，尤其是NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上表達(dá)升高 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Tim-3在慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于健康志愿者和脂肪肝患者對(duì)照（p<0.05）。進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示，Tim-3在NK細(xì)胞上高表達(dá)，而且慢乙肝患者外周血NK細(xì)胞上的Tim-3的表達(dá)水平顯著高于健康志愿者和脂肪肝患者（p<0.05）。此外，Tim-3在T細(xì)胞，尤其是CD8+T細(xì)胞上的表

14、達(dá)顯著高于健康志愿者和脂肪肝患者（p<0.0001）。 1.2 Tim-3在慢乙肝患者肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá)升高 為了進(jìn)一步研究Tim-3在慢乙肝患者肝臟內(nèi)的表達(dá)，我們收集慢乙肝患者和脂肪肝患者肝穿標(biāo)本，利用免疫組化的方法研究Tim-3在肝臟內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示，慢乙肝患者肝組織中Tim-3的表達(dá)顯著高于脂肪肝患者，而且從細(xì)胞形態(tài)上可以看出Tim-3主要在肝臟內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上表達(dá)。 1.3慢乙肝患者外周血T細(xì)胞和

15、CD8+T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平與ALT水平正相關(guān) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞上Tim-3表達(dá)水平與患者血清ALT水平均呈正相關(guān)（r=0.41，p<0.01），而與HBV DNA滴度并不相關(guān)，提示Tim-3很可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的功能參與肝損傷過(guò)程。 2.HBV感染可上調(diào)Tim-3表達(dá) 2.1 HBV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NK92細(xì)胞后可上調(diào)Tim-3的表達(dá) 2.2 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)單個(gè)

16、核細(xì)胞以及NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)升高 3 Tim-3抑制NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能 3.1 Tim-3阻斷后可上調(diào)NK細(xì)胞的殺傷功能 3.2 shRNA抑制Tim-3表達(dá)可上調(diào)HBV小鼠肝炎模型肝臟內(nèi)CD8+T細(xì)胞功能 結(jié)論: 1.慢乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，尤其是NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，及肝臟內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞上Tim-3表達(dá)顯著高于對(duì)照者。 2.HBV感染可上調(diào)NK92細(xì)胞