乙型肝炎病毒慢性感染小鼠模型的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 1. 構(gòu)建中國(guó)地區(qū)流行的B基因型HBV可復(fù)制性克隆，驗(yàn)證其在體內(nèi)和體外的復(fù)制能力，為HBV 復(fù)制相關(guān)研究及建立細(xì)胞和動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。
　　 2. 將具有良好復(fù)制能力的B基因型中國(guó)株HBV可復(fù)制性克隆亞克隆到腺相關(guān)病毒載體內(nèi)，建立HBV 慢性感染小鼠模型，同時(shí)建立A基因型HBV 慢性感染小鼠模型。
　　 3. 通過(guò)高壓尾靜脈注射的方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒和非病毒shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入到小鼠體內(nèi)，比較其抗HB

2、V的時(shí)效，以期獲得較長(zhǎng)期的HBV抑制效果。
　　 方法：
　　 1. 以一例中國(guó)HBV B基因型感染患者來(lái)源的全基因克隆為母板，使用Sap I 將HBV基因組切下后在體外自身環(huán)化。使用環(huán)化后的基因組為模板分兩段分別擴(kuò)增HBV1.3 倍基因組片段，依次將其連接到克隆載體pBluescript II KS(+)上獲得含HBV1.3基因組的克隆。通過(guò)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系和高壓尾靜脈注射BAL B/cJ小鼠建立體外和體內(nèi)HBV 復(fù)

3、制模型，采用ELISA、Southern Blot、Northern Blot以及免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)HBV 抗原分泌、復(fù)制中間體、轉(zhuǎn)錄子、抗原肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等情況，評(píng)價(jià)構(gòu)建克隆的復(fù)制能力。
　　 2. 將復(fù)制能力良好的HBV1.3 倍基因組亞克隆到腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS內(nèi)構(gòu)建pAAV-HBV1.3 質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測(cè)其復(fù)制能力。采用高壓尾靜脈注射的方式將pAAV-HBV1.3 克隆導(dǎo)入到C57 BL/

4、6小鼠肝臟內(nèi)，定期采血、取肝組織標(biāo)本通過(guò)ELISA、Southern Blot、RT-PCR 以及免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)HBV 抗原分泌、抗體產(chǎn)生、復(fù)制中間體、轉(zhuǎn)錄子、抗原肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等情況。同時(shí)使用Huang LR等報(bào)導(dǎo)的pAAV-HBV1.2 克隆高壓注射以建立A基因型的慢性感染小鼠模型。
　　 3. 根據(jù)所構(gòu)建的B基因型HBV可復(fù)制性克隆X 區(qū)序列設(shè)計(jì)RNAi 靶點(diǎn)，構(gòu)建shRNA表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，同pAAV-HBV

5、1.3 體外共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，篩選對(duì)HBV 復(fù)制抑制效果較好的干擾靶點(diǎn)shRNA表達(dá)載體，并據(jù)此構(gòu)建非病毒shRNA表達(dá)載體。將逆轉(zhuǎn)錄病毒及非病毒shRNA表達(dá)載體高壓尾靜脈注射導(dǎo)入小鼠肝臟，觀察其抗HBV 效果。
　　 結(jié)果：
　　 1.所構(gòu)建的HBV1.3 倍基因組克隆在Huh7細(xì)胞內(nèi)和在BAL B/cJ小鼠可以正常分泌HBsAg和HBeAg，檢測(cè)到復(fù)制中間體和轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)生。小鼠血清中可以檢測(cè)到高滴度HBV DNA

6、 并隨注射時(shí)間出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)可以檢出呈胞漿型和胞膜型表達(dá)的HBcAg。
　　 2. pAAV-HBV1.3和AAV-HBV1.2 兩種克隆均可在C57 BL/6小鼠體內(nèi)形成慢性HBV 復(fù)制狀態(tài)。在注射后的252天 (A)/340天(QS)仍可在血清HBsAg 陽(yáng)性小鼠肝組織內(nèi)檢測(cè)到HBV 復(fù)制中間體及HBV轉(zhuǎn)錄子的存在，肝細(xì)胞內(nèi)有HBcAg表達(dá)，而HBsAg 陰性的小鼠則無(wú)法檢出。小鼠血清HBV DNA含量可維持在1

7、0 5-10 7 copies/mL 水平，A組血清HBV DNA含量較QS組約高0.6-1.6log。但病毒血癥持續(xù)時(shí)間不及QS組長(zhǎng)，慢性化比例也低于QS組，注射24 周時(shí)A組陽(yáng)性率14.3%；QS組44.4%。
　　 3. 非病毒shRNA表達(dá)載體干預(yù)組小鼠血清HBsAg 陽(yáng)性率、HBsAg含量、血清病毒滴度的有效抑制時(shí)間為1 周以內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNA表達(dá)載體干預(yù)組HBV抑制時(shí)間可持續(xù)4-6 周，HBsAg 陽(yáng)性率在注射

8、后前4 周均保持在較低水平（18.2-27.3%），HBsAg含量下降第2 周仍可達(dá)81.0%，血清病毒滴度下降1.619-2.758log，小鼠肝組織內(nèi)HBcAg 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。兩組的抑制效果均隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。
　　 結(jié)論:
　　 1. 成功構(gòu)建了B基因型HBV可復(fù)制性克隆，在體內(nèi)外均具有良好的復(fù)制能力。
　　 2.建立了B基因型和A基因型的HBV 慢性感染小鼠模型。
　　 3.

9、直接高壓尾靜脈注射逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNA表達(dá)載體可以有效延長(zhǎng)RNAi作用時(shí)間，有效抑制時(shí)間可持續(xù)至少4 周。
　　 本課題的創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1. 首次構(gòu)建了同我國(guó)流行情況相符合的B基因型HBV可復(fù)制性克隆，并建立了HBV 慢性感染小鼠模型。
　　 2. 證實(shí)通過(guò)高壓尾靜脈注射方式導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNA 載體可以有效抑制HBV復(fù)制持續(xù)達(dá)4 周以上。
　　 本課題研究的意義:
　　 1. 構(gòu)建B基因型

10、HBV可復(fù)制性克隆為研究B基因型HBV 相關(guān)病毒變異、復(fù)制能力等HBV 生物學(xué)研究提供了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.建立的B基因型和A基因型的慢性HBV感染小鼠模型，具有易獲取、制備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、具有正常的機(jī)體免疫功能等優(yōu)點(diǎn)。為研究抗病毒治療、HBV 復(fù)制機(jī)制、HBV感染慢性化機(jī)制、免疫發(fā)病機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供了良好的小動(dòng)物模型。
　　 3. 高壓尾靜脈直接將逆轉(zhuǎn)錄病毒shRNA 載體導(dǎo)入體內(nèi)即可達(dá)到較長(zhǎng)期抑