NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗HBV感染免疫作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是當(dāng)前嚴(yán)重社會(huì)公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約20億人曾感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年大約100萬人死于HBV感染相關(guān)終末期肝病，因而成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界關(guān)注焦點(diǎn)之一。我國2006年HBV感染血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18％，據(jù)此推算我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬例，慢性乙型肝炎(chronic hepat

2、itis B，CHB)患者約2000萬例，其中15％～40％將可能死于肝衰竭、失代償期肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病，嚴(yán)重威脅國民的健康。CHB發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚存在諸多問題有待深入。近年來，隨著對CHB免疫機(jī)制認(rèn)識(shí)深入，國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為:HBV病毒本身并非造成肝細(xì)胞損害的首要原因，而病毒感染細(xì)胞誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的一系列免疫清除反應(yīng)才是造成CHB病理損傷的核心環(huán)節(jié)。因此，宿主免疫狀態(tài)是影響HBV感染后疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素之一，有效調(diào)節(jié)宿主

3、免疫功能，加強(qiáng)機(jī)體對HBV感染肝細(xì)胞的特異性識(shí)別，抑制甚或清除HBV并實(shí)現(xiàn)持久的免疫控制成為目前實(shí)現(xiàn)CHB理想治療目標(biāo)的重要策略。
　　 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）通過特異性殺傷機(jī)制在誘發(fā)組織免疫病理損傷、特異性清除HBV環(huán)節(jié)占據(jù)主導(dǎo)地位，但近來研究發(fā)現(xiàn)以自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK cells)、NKT細(xì)胞為首的非特異性免疫反應(yīng)在

4、防御甚至清除HBV感染過程中亦發(fā)揮重要作用。尤其當(dāng)HBV特異性CTL不足以清除病毒情況下，肝臟招募大量NK細(xì)胞向肝內(nèi)聚集、活化。在這一過程中:CXC家族趨化因子干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10(interferon gamma inducible protein 10 kD,IP-10)作為肝臟募集NK細(xì)胞關(guān)鍵趨化因子，必然對NK細(xì)胞在器官、組織中重分布，以及NK細(xì)胞所介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用;另一方面，以NKG2D為代表的NK細(xì)胞

5、膜受體活化在介導(dǎo)突破HBV感染后免疫耐受、啟動(dòng)非特異性和/或特異性免疫清除等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此，研究HBV感染者肝內(nèi)NK細(xì)胞募集、活化的機(jī)制及其信號(hào)通路，對明確HBV感染后慢性化/重癥化機(jī)制，探尋抗HBV免疫調(diào)控靶點(diǎn)、強(qiáng)化免疫調(diào)節(jié)療效等均具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目的:通過檢測慢性HBV攜帶者(chronic HBV carriers，AsC)、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HBV相關(guān)慢加急

6、性肝衰竭（HBV related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）患者外周血、肝組織中NK細(xì)胞數(shù)量、活性;NK細(xì)胞膜受體NKG2D及胞內(nèi)IFN-γ陽性表達(dá);血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NK細(xì)胞效應(yīng)分子IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B表達(dá)，以及NK細(xì)胞趨化因子IP-10表達(dá)及其與肝組織炎癥損傷、NK細(xì)胞聚集、HBV復(fù)制的關(guān)系等，探討慢性HBV感染不同臨床階段NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫差異，證實(shí)NK

7、細(xì)胞在介導(dǎo)慢性HBV感染者免疫活化、病理損傷、肝炎重癥化等方面的作用與機(jī)制。另一方面，通過對臨床聚乙二醇干擾素α(pegylated interferon alpha，Peg IFN-α)抗病毒治療CHB患者的隊(duì)列研究，觀察NK細(xì)胞活化、IP-10基線表達(dá)與動(dòng)態(tài)變化等對抗病毒治療應(yīng)答的影響，初步評估NK細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)對干擾素抗病毒治療應(yīng)答的預(yù)測價(jià)值，并結(jié)合PegIFN-α聯(lián)合阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)抗病毒

8、治療臨床療效觀察，為CHB患者探求免疫調(diào)控靶點(diǎn)及臨床優(yōu)化抗病毒策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、NKG2D介導(dǎo)NK細(xì)胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響
　　 依據(jù)我國2010年《慢性乙型肝炎防治指南》、2006年《肝衰竭診療指南》診斷、分型標(biāo)準(zhǔn)，入選AsC、CHB、HBV-ACLF患者各15例，同期篩選15例健康獻(xiàn)血員作為健康對照組(healthy controls，HC)。所有納患

9、者入組前6月均未曾接受過免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及乙肝疫苗治療;排除HAV、HCV、HEV、EBV、CMV、HIV等合并感染;無合并酒精、藥物、代謝性、免疫性肝病及惡性腫瘤等。全自動(dòng)生化分析儀測定血清白蛋白(albumin，Alb)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)等;酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assa

10、y，ELISA)檢測血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測血清HBVDNA載量;電化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence，ECL)定量檢測HBsAg、HBeAg滴度。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測NK（CD3-CD56

11、+）細(xì)胞、NKG2D+NK細(xì)胞頻率，胞內(nèi)因子染色法檢測IFN-γ+NK細(xì)胞頻率。肝組織標(biāo)本蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察炎癥、壞死程度;免疫組織化學(xué)（immunohi stochemistry，IHC）染色觀察NK(CD3-CD57+)細(xì)胞分布、數(shù)量，NKG2D+、IFN-γ+細(xì)胞表達(dá);RealtimePCR檢測NKG2D、IFN-γmRNA表達(dá)。
　　 2、NKG2D信號(hào)通路在TNF-α誘導(dǎo)

12、NK細(xì)胞活化殺傷HBV復(fù)制靶細(xì)胞機(jī)制中的作用
　　 復(fù)蘇HepG2細(xì)胞以含10％胎牛血清、1％青鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)基于5％CO2，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于六孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，至60％～70％細(xì)胞融合時(shí)更換新鮮完全培養(yǎng)基，以VigoFect高效轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，24h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞（HBV-HepG2細(xì)胞），傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液Real-timePCR測定HBVDNA載量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并篩選H

13、BVDNA≥5.0×106拷貝/ml細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同期復(fù)蘇NK-92細(xì)胞，以含12.5％胎牛血清、12.5％馬血清、200IU/mlIL-2、0.5ng/mlIL-15的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，MTT法驗(yàn)證NK-92細(xì)胞殺傷活性，而后分組干預(yù):單細(xì)胞培養(yǎng)組、單細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)組、聯(lián)合培養(yǎng)組、聯(lián)合培養(yǎng)干預(yù)組。經(jīng)24h處理后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。ELISA檢測上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平，Real-time

14、PCR定量檢測HBVDNA載量。
　　 3、干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10募集NK細(xì)胞肝臟遷移對CHB抗病毒應(yīng)答影響
　　 橫斷面研究:病例篩選，血清ALT水平、HBVDNA載量，PBMCs中NK細(xì)胞頻率、肝組織炎癥活動(dòng)度（inflammation activity，IA）積分等同第一部分。另外，ELISA法檢測血清IFN-γ及其誘導(dǎo)蛋白-10(interferon gamma inducible protein 10 kD，

15、IP-10)水平;IHC染色觀察肝組織IFN-γ、IP-10陽性表達(dá);RealtimePCR檢測肝組織IFN-γ、IP-10mRNA表達(dá)。
　　 隊(duì)列研究:納入2010年1月～2011年12月接受PegIFNα抗病毒治療CHB患者60例，入選病例符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足下列條件:18～65歲;HBVDNA≥104拷貝/ml;80U/L＜ALT＜400U/L，和/或經(jīng)肝組織病理證實(shí)炎癥分級≥G2;6個(gè)月

16、內(nèi)未曾接受過抗病毒、免疫調(diào)節(jié)劑及乙肝疫苗治療。排除妊娠及哺乳期女性，無HAV、HCV、HEV或HIV合并感染，無惡性腫瘤、自身免疫性疾病、未控制的糖尿病、甲狀腺疾病，既往精神病史，或其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病、干擾素用藥禁忌等情況。收集患者抗病毒治療前、治療中、停藥隨訪期血清，用于ALT、AST、HBVDNA、HBsAg、HBeAg及細(xì)胞因子IFN-γ、IP-10動(dòng)態(tài)監(jiān)測;收集部分患者治療前、后肝穿刺組織標(biāo)本，進(jìn)行組織病理及分子生物學(xué)檢測（檢測指

17、標(biāo)及方法同橫斷面研究）。
　　 4、Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個(gè)體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效
　　 本隊(duì)列研究納入符合干擾素抗病毒治療HBeAg陽性CHB患者160例（納入與排除標(biāo)準(zhǔn)同前）。所有患者1∶1比例隨機(jī)分配進(jìn)入干擾素標(biāo)準(zhǔn)治療組和個(gè)體化治療組。標(biāo)準(zhǔn)治療組患者接受PegIFNα-2a標(biāo)準(zhǔn)治療，個(gè)體化治療組又依據(jù)患者基線HBVDNA載量和/或肝纖維化程度亞分為初始PegIFNα-2a與ADV聯(lián)

18、合治療組（38例，HBV＞1.0×107copies/ml和/或肝纖維化≥S3）和初始PegIFNα-2a單藥治療組（42例）。治療24周后，對個(gè)體化治療組療效初評，并依據(jù)抗病毒應(yīng)答重新分組:對HBVDNA低于檢測下限、HBeAg清除及ALT復(fù)?；颊?，繼續(xù)（或調(diào)整為）PegIFNα-2a單藥治療，余者均繼續(xù)（或調(diào)整為）PegIFNα-2a聯(lián)合ADV治療至療程結(jié)束。所有患者均接受至少48周抗病毒治療，并隨訪至96周，常規(guī)檢測生化學(xué)、病毒學(xué)

19、、血清學(xué)等指標(biāo)及血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能等，動(dòng)態(tài)觀察患者抗病毒治療療效、安全性、耐藥率及停藥復(fù)發(fā)率等。
　　 結(jié)果:
　　 1、NKG2D介導(dǎo)NK細(xì)胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響
　　 1.1、人口基線特征與血清指標(biāo)特點(diǎn):
　　 各組患者在年齡構(gòu)成、性別比例具有可比性。HBV-ACLF患者血清ALT、TBil水平均顯著高于、PTA水平顯著低于CHB及AsC患者（均P＜0.01）。與CHB

20、患者相比，HBV-ACLF患者HBVDNA載量、HBeAg滴度偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.2、血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平變化:
　　 HBV-ACLF組患者血清IFN-γ（10.78±1.19pg/ml）、TNF-α(118.25±25.36pg/ml)水平均顯著高于CHB組（6.98±1.12pg/ml;69.54±17.35pg/ml）、AsC組（2.24±

21、0.45pg/ml;26.25±6.37pg/ml），兩兩比較各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。各組血清IFN-γ、TNF-α水平以健康對照組（1.98±0.58pg/ml;24.58±6.15pg/ml）最低，但與AsC組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 血清穿孔素、顆粒酶B變化趨勢與IFN-γ一致，以HBV-ACLF組最高（5.96±1.89ng/ml;12.56±2.28pg/ml），其后依次為CHB組（

22、2.75±0.58ng/ml;3.52±0.96pg/ml）、AsC組（1.58±0.59ng/ml;2.34±0.65pg/ml）和健康對照組（1.58±0.42ng/ml;2.25±0.48pg/ml），除AsC組與健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其它各組兩兩比較具差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.3、外周血CD3-CD56+(NK)細(xì)胞，NKG2D+與IFN-γ+NK細(xì)胞頻率比較:<

23、br>　　 與健康對照組（13.58±3.24）％相比，慢性HBV感染各組PBMCs中CD3-CD56+(NK)細(xì)胞頻率均不同程度降低，以AsC組（5.42±2.18）％最低。CHB組（8.43±2.92）％、HBV-ACLF（7.92±2.85）％組患者NK細(xì)胞頻率較AsC患者不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但仍顯著低于健康對照組水平（均P＜0.01），而HBV-ACLF與CHB組患者NK細(xì)胞頻率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

24、異（P＞0.05）。
　　 與NK細(xì)胞頻率趨勢不同，NKG2D+和IFN-γ+NK細(xì)胞占全部NK細(xì)胞比例以ACLF組患者[（18.92±5.85）％;（42.25±10.17）％]最高，其后依次為CHB組[（12.85±3.39）％;（27.95±6.12）％]、健康對照組[（8.45±2.86）％;（18.69±5.68）％]及AsC組[（3.36±1.05）％;(12.55±3.24)％]，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

25、（P＜0.01或＜0.05）。
　　 1.4、肝組織CD3-CD57+NK細(xì)胞，及NKG2D+、IFN-γ+細(xì)胞的表達(dá):
　　 CHB與HBV-ACLF患者CD3-CD57+NK細(xì)胞呈彌漫分布，以淋巴細(xì)胞密集的匯管區(qū)、炎癥壞死區(qū)明顯，在健康對照組及AsC患者極少數(shù)陽性表達(dá)NK細(xì)胞散在分布于肝竇內(nèi)及匯管區(qū)。半定量分析顯示，HBV-ACLF患者肝組織浸潤的CD3-CD57+NK細(xì)胞(19.6±3.5/hpf)顯著多于CHB組

26、(8.4±3.5/hpf)、AsC組(2.5±1.3/hpf)和健康對照組(1.2±0.6/hpf)，除AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 NKG2D+細(xì)胞主要分布于淋巴細(xì)胞聚集的炎癥壞死區(qū)。IFN-γ在健康對照組與AsC患者主要表達(dá)于個(gè)別肝細(xì)胞，而在HBV-ACLF與CHB患者同樣以炎癥壞死區(qū)浸潤的淋巴細(xì)胞表達(dá)為著。半定量分析顯示NKG2D+、IF

27、N-γ+細(xì)胞均以HBV-ACLF組表達(dá)最強(qiáng)、AsC組最弱，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 1.5、肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA表達(dá)變化:
　　 將健康對照組肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA相對表達(dá)量設(shè)定為1.00。HBV-ACLF患者肝組織NKG2D（6.58±1.86）、IFN-γ（3.56±0.63）mRNA相對表達(dá)量最高，其后依次為CHB組（3.25±0.95;1.54

28、±0.33）和AsC組（0.69±0.20;0.52±0.09），各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。AsC組患者肝組織中NKG2D、IFN-γmRNA相對表達(dá)量均低于健康對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 2、NKG2D信號(hào)通路在TNF-α誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化殺傷HBV復(fù)制靶細(xì)胞機(jī)制中的作用
　　 2.1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功制備HBV復(fù)制型肝細(xì)胞:
　　 利用野生型HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染He

29、pG2細(xì)胞，篩選高復(fù)制HBVDNA細(xì)胞株（HBV-HepG2）。RealtimePCR檢測HBV-HepG2細(xì)胞上清液中HBVDNA載量1.0×105-1.0×107拷貝/ml，ELISA法檢測上清液HBsAg陽性，轉(zhuǎn)染HBV-HepG2細(xì)胞釋放IFN-γ、TNF-α水平較未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞輕度升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　 2.2、NK細(xì)胞殺傷活性:
　　 經(jīng)IL-2與IL-15誘導(dǎo)維持生長的N

30、K-92細(xì)胞具有低水平殺傷活性，IFN-α刺激后，殺傷活性明顯增強(qiáng)，尤其對于HBV-HepG2細(xì)胞殺傷活性更強(qiáng)。應(yīng)用特異性單克隆抗體封閉NKG2D受體后，NK細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷活性減低，尤其對經(jīng)IFN-α誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞的殺傷活性下降更為顯著，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）。
　　 2.3、NK細(xì)胞對HBV-HepG2中HBVDNA載量的影響:
　　 應(yīng)用單獨(dú)培養(yǎng)HBV-HepG2細(xì)胞，上清液中

31、HBVDNA載量略有下降。未經(jīng)IFN-α干預(yù)的NK細(xì)胞與HBV-HepG2細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA也僅輕微下降(P＞0.05)，但經(jīng)IFN-α干預(yù)后聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA載量下降顯著(P＜0.05)。NKG2DmAb可部分阻斷NK細(xì)胞對HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)，尤其阻斷經(jīng)IFN-α誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞對HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)(P＜0.05)。
　　 2.4、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B含量變化:<

32、br>　　 IL-2與IL-15誘導(dǎo)維持生長的NK-92細(xì)胞培養(yǎng)上清液可檢測出低水平TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B。經(jīng)IFN-α刺激后上述指標(biāo)不同程度增加（P＜0.05或＜0.01），以IFN-γ升高最著。聯(lián)合培養(yǎng)組上清液TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平均較單獨(dú)培養(yǎng)組升高（均P＜0.01），且經(jīng)IFN-α刺激后較未經(jīng)IFN-α刺激的聯(lián)合培養(yǎng)組和經(jīng)IFN-α刺激的單獨(dú)培養(yǎng)組均顯著升高（均P＜0.01）。應(yīng)用NKG2

33、DmAb封閉可以顯著抑制IFN-α對上述指標(biāo)的上調(diào)效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），但NKG2DmAb阻斷未能將上述指標(biāo)恢復(fù)至干預(yù)前水平。
　　 3、干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10募集NK細(xì)胞肝臟遷移對CHB抗病毒應(yīng)答影響
　　 3.1、各組人口基線特征及血清指標(biāo)特點(diǎn):
　　 健康對照組、AsC及HBV-ACLF組患者人口基線特征、血清生化學(xué)及病毒學(xué)指標(biāo)特點(diǎn)同第一部分(1.1)。另外60例前瞻隊(duì)列研究CHB患

34、者，平均年齡37±12(16～65)歲。其中38例HBeAg陽性、22例HBeAg陰性，兩亞組間在年齡分布、性別比例方面均具有可比性(P＞0.05)。
　　 3.2、抗病毒治療CHB患者生化學(xué)、病毒學(xué)及血清學(xué)應(yīng)答特點(diǎn):
　　 所有CHB患者均至少完成48周PegIFN-α抗病毒治療，并于停藥后隨訪48周。至隨訪結(jié)束，76.67％(46/60)患者ALT復(fù)常，65.00％(39/60)HBVDNA低于檢測下限（＜500拷貝

35、/ml）。58.33％(35/60)HBsAg下降＞1log10IU/ml，其中23例患者治療前為HBeAg陽性、12例HBeAg陰性，僅8.33％(5/60)患者發(fā)生HBsAg清除。38例HBeAg陽性患者60.53％(23/38)實(shí)現(xiàn)HBeAg清除，其中20例同時(shí)出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。
　　 3.3、各組血清IP-10、IFN-γ基線水平:
　　 HBV-ACLF與CHB組患者血清IP-10、IFN-γ基線水平明

36、顯高于AsC和健康對照組（均P＜0.01），且以HBV-ACLF組最高，并與CHB組比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HBeAg陽性患者血清IP-10水平高于HBeAg陰性患者（P＜0.01）?；仡櫺苑治鲲@示HBeAg清除、HBsAg下降＞1log10IU/ml患者較HBeAg持續(xù)陽性及HBsAg下降＜1log10IU/ml患者基線IP-10水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

37、r>　　 3.4、CHB患者抗病毒治療過程中血清IP-10動(dòng)態(tài)變化:
　　 伴隨抗病毒治療血清IP-10水平逐漸下降，尤其以HBeAg清除、HBsAg下降＞1log10IU/ml患者下降更為明顯，不僅顯著低于治療基線水平(P＜0.01)，其下降幅度與HBeAg持續(xù)陽性、HBsAg下降＜1log10IU/ml患者相比同樣具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。不僅如此，對HBsAg下降＞1log10IU/ml組患者IP-10動(dòng)態(tài)監(jiān)測

38、顯示IP-10下降曲線與HBsAg下降曲線高度一致，尤其是在抗病毒治療期間。
　　 3.5、各組肝組織IP-10mRNA和蛋白表達(dá)差異:
　　 將健康對照者肝組織IP-10mRNA表達(dá)量設(shè)定為1.00，以HBV-ACLF患者肝組織IP-10mRNA相對表達(dá)量最高（8.51±0.64），顯著高于CHB組（4.01±0.74）和AsC組（1.04±0.03），各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01或＜0.05）。IP-

39、10蛋白表達(dá)趨勢與mRNA一致，也以ACLF患者最高，其后依次為CHB、AsC和健康對照組。除AsC和健康對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，HBeAg陽性CHB患者肝組織IP-10mRNA、蛋白表達(dá)水平亦高于HBeAg陰性患者(P＜0.01)。
　　 3.6、血清IP-10水平與血清ALT、HBVDNA、HBsAg定量，PBMCs中IFN-γ+NK頻率，肝組織IA積分、IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)相關(guān)

40、性分析:
　　 血清IP-10水平與肝組織IP-10mRNA、蛋白表達(dá)相關(guān)性良好。治療前IP-10水平與血清ALT水平、PBMCs中IFN-γ+NK頻率、肝組織IA積分及IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.65，0.60，0.77，0.64，P＜0.01），而與血清HBVDNA載量、HBsAg滴度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.69，-0.59，P＜0.01）
　　 3.7、基線高IP-10水平(＞350pg/ml)對PegIF

41、N-α抗病毒治療HBeAg清除與HBsAg下降的預(yù)測價(jià)值:
　　 Logistic多元回歸分析顯示，治療前高IP-10水平(OR，6.068;95％CI,1.274-28.902)、ALT水平(OR,3.745;95％CI,0.826-16.983)是HBeAg清除的獨(dú)立預(yù)測因素。同樣高水平IP-10(OR，4.677;95％CI，1.102-19.841)、ALT(OR,3.186;95％CI,0.842-12.048)，以及

42、低HBVDNA載量(OR，0.364;95％CI，0.131-1.013)是HBsAg下降的獨(dú)立預(yù)測因素。相比而言，IP-10較其它指標(biāo)具有更強(qiáng)的預(yù)測效力。
　　 4、PegIFN-α2a聯(lián)合ADV個(gè)體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效
　　 4.1、病毒學(xué)應(yīng)答:
　　 治療24周，個(gè)體化治療組僅8.75％(7/80)患者HBVDNA載量較治療前無下降，其中1例在初始聯(lián)合治療組、6例在初始PegIFNα

43、-2a單藥治療組。雖然低于標(biāo)準(zhǔn)治療組16.25％(13/80)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。48周治療結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組72.50％(58/80)患者HBVDNA低于檢測下限，高于標(biāo)準(zhǔn)治療組53.75％(43/80)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨訪期間，兩組患者HBVDNA反彈率分別為18.97％(11/58)和11.63％(5/43)。至隨訪結(jié)束后，兩組HBVDNA低于檢測下限率分別降至58.75％(47/80)和47

44、.50％(38/80)，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.2、生化學(xué)應(yīng)答:
　　 治療24周時(shí)，個(gè)體化治療組ALT復(fù)常率57.50％(46/80)，包括初始聯(lián)合治療組25例，初始單藥治療組21例，高于標(biāo)準(zhǔn)治療組40.00％(32/80)（P＜0.05）。但至隨訪結(jié)束時(shí)，兩組ALT復(fù)常率分別升至78.75％(63/80)和71.25％(57/80)，差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　

45、 4.3、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與HBsAg消失率:
　　 48周治療結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組HBeAg清除率、血清轉(zhuǎn)換率及HBsAg消失率分別為63.75％、56.25％和15.00％，而標(biāo)準(zhǔn)治療組僅分別為45.00％、37.50％和8.75％，兩組在HBeAg清除與血清轉(zhuǎn)換率方面比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。隨訪結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組HBeAg血清轉(zhuǎn)換率及HBsAg消失率分別調(diào)至53.75％和17.50％，高于標(biāo)準(zhǔn)治

46、療組32.50％和10.00％，但僅HBeAg血清轉(zhuǎn)換率在兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，全部患者中38.75％(62/160)獲得聯(lián)合應(yīng)答（HBVDNA低于檢測下限、HBeAg清除或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，或伴有HBsAg消失），其中38例為個(gè)體化治療組、24例為標(biāo)準(zhǔn)治療組患者。
　　 4.4、安全性評估
　　 全部患者中無因不良反應(yīng)退出試驗(yàn)者，僅1例患者因A181V位點(diǎn)突變調(diào)整為替比夫定治療。其中2例患者出現(xiàn)

47、三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素升高，同時(shí)伴隨促甲狀腺素下降。經(jīng)減量PegIFNα-2a劑量后各指標(biāo)逐漸恢復(fù)至正常。15例患者因粒細(xì)胞顯著降低下調(diào)PegIFNα-2a用量，但未出現(xiàn)因不良反應(yīng)而致ADV減量或停藥事件。3例患者治療后二次肝穿發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度加重，但臨床無失代償期肝病及死亡病例發(fā)生。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢性HBV感染者不同臨床階段NK細(xì)胞頻率、活性、分布存在差異，提示以NK細(xì)胞為代表的固有免疫應(yīng)答參與HBV感

48、染后宿主免疫調(diào)節(jié)，并影響疾病進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸。
　　 2、NK細(xì)胞在肝臟內(nèi)募集、活化，參與肝臟免疫炎癥損傷，其機(jī)制部分依賴于NK細(xì)胞膜受體NKG2D活化以及合成、分泌IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B等效應(yīng)分子能力。
　　 3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功制備HBV復(fù)制肝細(xì)胞模型，通過與NK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)證實(shí)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的非特異殺傷活性，且IFN-α可能通過上調(diào)NKG2D受體活化及促進(jìn)IFN-γ分泌強(qiáng)化NK細(xì)胞抗病毒效應(yīng)。
　　

49、 4、體外阻斷NKG2D信號(hào)通路能有效抑制NK細(xì)胞效應(yīng)分子合成、釋放，下調(diào)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷活性，反證NKG2D是介導(dǎo)NK細(xì)胞抗HBV感染免疫的重要信號(hào)通路之一。
　　 5、IP-10作為NK細(xì)胞重要趨化因子，參與HBV-ACLF患者外周NK細(xì)胞向肝內(nèi)遷移、聚集，并與肝組織炎癥活動(dòng)度相關(guān)，提示有效調(diào)節(jié)IP-10可減輕由NK細(xì)胞所介導(dǎo)的肝臟免疫病理損傷。
　　 6、IP-10基線水平及動(dòng)態(tài)演變與PegIFN-α抗病毒應(yīng)