TLR3在人類胎盤HBV感染中作用的研究.pdf

1、目的:為了研究TLR3在人類胎盤HBV感染中的作用，本課題采用人群研究和體外實驗相結合的方法，從基因和蛋白水平初步了解正常孕婦人群與HBsAg陽性孕婦人群胎盤組織TLR3的表達和分布情況以及與HBV宮內(nèi)感染的關系，根據(jù)人群研究提供的線索進一步進行體外實驗，探索TLR3在胎盤細胞抵御HBV感染中的作用。 ①了解TLR3受體在正常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織的基因表達及蛋白分布情況； ②了解胎盤組織TLR3mRNA表達與

2、孕婦HBV感染的關系；從基因水平了解胎盤組織TLR3mRNA與孕婦外周血HBVDNA含量的關系以及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關系；從蛋白水平了解TLR3與胎盤HBV感染的關系及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關系； ③研究HBV感染對人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3mRNA表達的影響，觀察人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3抗HBV感染的生物學作用。 方法: ①普通半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測正

3、常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3mRNA的表達情況，免疫組織化學ABC法檢測正常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3分布情況： ②熒光定量PCR檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒HBVDNA含量； ③建立HBV體外感染人胎盤滋養(yǎng)層細胞模型；高濃度HBVDNA陽性血清與Bewo細胞共培養(yǎng)，熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清中HBVDNA含量；免疫組織化學ABC法檢測細胞爬片Bewo細胞中HBsAg； ④普通半

4、定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中，TLR3mRNA的表達；HBV感染前后人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3mRNA表達的變化；利用PolyI:C刺激Bewo細胞TLR3mRNA的表達，設計合成特異的siRNA阻抑Bewo細胞TLR3mRNA的表達，同時設對照組，RealtimeRT-PCR檢測三組細胞經(jīng)不同措施干預后TLR3mRNA的表達變化，同時檢測用108copies/ml濃度的HBV

5、DNA陽性血清與上述三組細胞共同培養(yǎng)后上清液中HBVDNA含量的變化。 結果: ①半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR結果均顯示HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3mRNA含量低于正常孕婦胎盤組織(t=3.003，P＜0.05；t=4.698，P＜0.05)；免疫組化檢測41例正常孕婦胎盤TLR3全部陽性，且各層細胞均顯示很強的免疫印跡，呈片狀分布；所檢116例外周血HBsAg陽性孕婦胎盤組織中73.0％TLR

6、3受體陽性，棕黃色信號局灶性分布于被檢胎盤的各型細胞中；TLR3在兩組的胎盤分布經(jīng)統(tǒng)計學檢驗差異有顯著性(Fisher's確切概率P＜0.01)； ②胎盤組織TLR3mRNA水平與孕婦外周血HBVDNA含量無關(F=0.147，P＞0.05)：胎盤組織TLR3mRNA水平與新生兒宮內(nèi)感染無關(t=0.888，P＞0.05)； ③從蛋白水平研究TLR3與胎盤HBV感染及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關系，結果顯示TLR3陽性不僅

7、是胎盤HBV感染的保護因素(OR=0.259，0.189～0.354)，同時也是新生兒HBV宮內(nèi)感染的保護因素(OR=0.438，0.204～0.942)之一。 ④HBVDNA陽性血清與Bewo細胞共培養(yǎng)24小時組、48小時組，在細胞感染后不同時段(24小時、48小時、72小時)的培養(yǎng)上清中均可檢出HBVDNA；免疫組織化學ABC法檢測細胞爬片Bewo細胞內(nèi)HBsAg的表達，陽性物質(zhì)呈細小棕黃色顆粒，多數(shù)呈胞漿均質(zhì)型，少數(shù)呈胞漿

8、不均質(zhì)型，少數(shù)細胞核內(nèi)亦可見陽性表達。光鏡下HBsAg陽性細胞未見形態(tài)學上的明顯變化。 ⑤經(jīng)普通半定量RT-PCR和RealtimeRT-PCR檢測證實人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3mRNA的表達呈陽性；HBV感染Bewo細胞后TLR3mRNA表達高于對照組(t=4.479，P＜0.05)；PolyIC刺激Bewo細胞后，TLR3mRNA的表達水平高于siRNA組和對照組(H=13.087，P＜0.05；H=1.3.100

9、，P＜0.017)，siRNA組和對照組細胞TLR3mRNA含量無差別(H=3.287，P＞0.05)；用108copies/ml濃度的HBVDNA陽性血清與上述三組細胞共同培養(yǎng)后，三組均可檢出HBVDNA，PolyI:C組上清中HBVDNA含量低于siRNA組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.531，P＜0.05)；siRNA組和對照組差異無統(tǒng)計學意義(LSD檢驗P＞0.05)。 結論: ①胎盤組織TLR3表達情況與

10、孕婦乙型肝炎病毒感染有關，TuR3高表達是孕婦乙型肝炎病毒感染的保護因素； ②蛋白水平的檢測結果顯示，HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3陽性率低于正常孕婦胎盤組織，TLR3是孕婦胎盤HBV感染的保護因素，同時也是HBV宮內(nèi)感染的保護因素； ③乙型肝炎病毒可在體外成功感染人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo;體外培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo可穩(wěn)定表達TLR3，也可被乙型肝炎病毒直接感染，故此模型可作為研究HBV胎盤感染機制的良好