MSCs的分離培養(yǎng)鑒定及MSCs-si NRSF的構(gòu)建和檢測.pdf

1、目的:糖尿病是威脅人類健康的重要疾病。目前,移植胰島治療糖尿病已初見療效,但由于胰島來源匱乏和免疫排斥反應(yīng)而受阻。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源廣泛,取材簡單,在體外易于分離、培養(yǎng)和純化,且具有多向分化的潛能,是進(jìn)行細(xì)胞移植的理想種子細(xì)胞。然而MSCs向胰島細(xì)胞的誘導(dǎo)分化陽性比率低、分化細(xì)胞的胰島素分泌功能差等不足成為制約目前分化方案的主要障礙。神經(jīng)元限制性沉默因子(neuronal re

2、strictive silencing factor,NRSF),在胚胎干細(xì)胞及成體細(xì)胞中均有表達(dá),但在成熟的神經(jīng)元和胰島細(xì)胞中卻沒有表達(dá)。因此提示NRSF在干細(xì)胞的干性維持及胰腺發(fā)育可能發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)干涉NRSF后的MSCs,經(jīng)過胰高血糖素GLP-1及bFGF等細(xì)胞生長因子的輔助誘導(dǎo)下,分化為胰島樣細(xì)胞的效率明顯增加。在本實驗中,我們通過RNA干涉技術(shù),下調(diào)MSCs內(nèi)源NRSF表達(dá),并分析干涉NRSF后MSCs向胰島樣細(xì)胞

3、分化的能力。
　　 方法:
　　 無菌條件下,自正常成人骨髓分離單個核細(xì)胞,采用密度梯度離心和貼壁消化傳代的方法行體外擴(kuò)增純化,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定表型、脂肪樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化鑒定分化潛能,獲取合格MSCs;采用NRSF慢病毒干涉載體包裝人胚腎293FT細(xì)胞,收集含有病毒顆粒的培養(yǎng)上清,轉(zhuǎn)染MSCs,倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,建立穩(wěn)定干涉內(nèi)源性NRSF的MSCs(MSCs-siNRSF);參照楊印祥等報道的方法,定向誘導(dǎo)

4、MSCs-siNRSF胰島樣細(xì)胞方向分化,雙硫腙染色鑒定胰島細(xì)胞形成,RT-PCR法檢測胰島素基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.MSCs的形態(tài)學(xué)鑒定采用密度梯度離心和貼壁消化傳代的方法,自正常人骨髓獲取的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的MSCs生長形態(tài)。
　　 2.MSCs的表型鑒定流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,密度梯度離心和貼壁消化傳代的細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD44、CD90,不表達(dá)造血干細(xì)胞及成熟造血細(xì)胞標(biāo)志CD3、CD49d。提

5、示分離獲取的細(xì)胞具有MSCs表性特征。
　　 3.MSCs的分化潛能鑒定經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后,密度梯度離心和貼壁消化傳代的細(xì)胞胞質(zhì)中可出現(xiàn)大小不一的脂滴,油紅染色后脂滴為紅色。提示分離獲取的細(xì)胞具有脂肪樣細(xì)胞分化潛能。
　　 4.MSCs-siNRSF的構(gòu)建倒置熒光顯微鏡下觀察,攜帶綠色熒光蛋白慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的MSCs,可見穩(wěn)定的綠色熒光信號。提示MSCs-siNRSF構(gòu)建成功。
　　 5.MSCs-siNRSF胰

6、島樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化經(jīng)胰島樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后,MSCs-siNRSF逐漸變圓,并聚集成團(tuán);RT-PCR結(jié)果顯示胰島素基因表達(dá);雙硫腙染色陽性。提示MSCs-siNRSF可成功誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.采用密度梯度離心與貼壁消化傳代法,可獲得合格的MSCs。
　　 2.所分離的MSCs具有干細(xì)胞形態(tài)及分化潛能。
　　 3.成功地構(gòu)建MSCs-siNRSF,進(jìn)一步檢測有助于MSCs體