MSCs與去分化MSCs在成骨分化過(guò)程中免疫原性上調(diào)的研究.pdf

1、目的：
　　比較間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells,MSCs）與去分化間充質(zhì)干細(xì)胞（De-differentiated mesenchymal stem cells,De-MSCs）的成骨分化潛能，并探究MSCs與De-MSCs在成骨分化過(guò)程中免疫原性的改變及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　用酶消化法從人胎盤中分離得到MSCs，經(jīng)鑒定后，采用更換培養(yǎng)基的方法誘導(dǎo)得到De-MSCs，并對(duì)De-MSCs

2、鑒定后用于實(shí)驗(yàn)。
　?。?）比較MSCs與De-MSCs的成骨分化潛能，用CCK8法檢測(cè)MSCs與De-MSCs成骨誘導(dǎo)7d過(guò)程中的增殖效率；MSCs與De-MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7d后分別得到Ob-MSCs和Re-MSCs，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR，SYBR Green法）檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)；ALP染色比較MSCs與De-MSCs成骨分化的效率。
　　（2）采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)MSCs，Ob-MSCs，De

3、-MSCs和Re-MSCs表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)情況；并將4種細(xì)胞與T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，CCK8法檢測(cè) T細(xì)胞的增殖，檢測(cè)MSCs與De-MSCs在體外成骨分化過(guò)程中免疫原性的改變。
　　（3）將絲裂霉素C處理的MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs通過(guò)皮下植入免疫BALB/c小鼠，免疫5d后，眼眶靜脈取外周血，采用FCM檢測(cè)外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中免疫細(xì)胞群的活化情況；免疫7d后，采用FCM檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞

4、中免疫細(xì)胞群的活化情況，檢測(cè)MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs對(duì)小鼠的致敏情況。
　　（4）實(shí)時(shí)定量PCR（q-PCR，Taqman探針?lè)ǎz測(cè)MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs中與免疫（miR-125b和miR-296）和成骨（miR-20a和miR-29b）相關(guān)的micro RNA（miRNA）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　（1）De-MSCs與MSCs具有相似的細(xì)胞形態(tài)

5、、干細(xì)胞標(biāo)志與多向分化潛能。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖顯示出在成骨誘導(dǎo)7d的過(guò)程中，De-MSCs較MSCs有更高的增殖效率。q-PCR結(jié)果顯示Re-MSCs中成骨相關(guān)基因BMP2，COL1和Runx2的表達(dá)較Ob-MSCs明顯增高。ALP染色顯示De-MSCs較MSCs具有更強(qiáng)的成骨能力。
　?。?）流式結(jié)果顯示，MSCs與De-MSCs體外成骨分化的過(guò)程中，正性共刺激分子的表達(dá)明顯增高，負(fù)性共刺激分子的表達(dá)明顯下降，且這種現(xiàn)象在D

6、e-MSCs中表現(xiàn)的更加明顯?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)（MLR）顯示，MSCs與De-MSCs可以抑制T細(xì)胞的增殖，但成骨分化后抑制T細(xì)胞增殖的程度降低，且Re-MSCs組T細(xì)胞的增殖效率高于Ob-MSCs組。
　　（3）PBMCs的流式結(jié)果顯示，分化的Ob-MSCs和Re-MSCs致敏小鼠后，PBMCs中的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞的活化效果均要高于相應(yīng)的未分化的MSCs和De-MSCs致敏的小鼠。同時(shí)，Re-MSCs致敏的效

7、果高于Ob-MSCs組。以上現(xiàn)象在脾臟細(xì)胞的流式結(jié)果中體現(xiàn)的更加明顯。
　　（4）miR-20a和miR-29b與成骨有關(guān)，而miR-125b與miR-296與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。q-PCR結(jié)果顯示，miR-20a和miR-125b在MSCs與De-MSCs成骨分化的過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，而miR-29b和 miR-296在成骨分化的過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，且miRNAs在De-MSCs分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào)與上調(diào)的幅度均明顯高于MSCs。
　　結(jié)