HAp-Col-CTS仿生納米纖維對iPSC-MSCs的成骨分化誘導作用研究.pdf

1、利用仿生生物材料支架復合干細胞來修復和再生各類傷病組織或器官，是近年來組織工程與再生醫(yī)學的一個研究熱點。本文主要目的是研究通過電紡絲技術制備羥基磷灰石/膠原/殼聚糖（HAp/Col/CTS）納米纖維支架來仿生天然骨組織的組分及納米纖維結構，然后探索該支架對誘導性多能干細胞來源的間充質干細胞（iPSC-MSCs）的體外成骨誘導作用以及體內骨缺損的修復和再生功效。
　　作為一種新的干細胞體系，iPSCs是由體細胞重編程而來，并具有強大

2、自我更新能力和分化潛能的多能干細胞。與胚胎干細胞相比， iPSCs具有可建立大批量同源細胞而無倫理爭議和免疫排斥性的優(yōu)勢；與間充質干細胞相比，iPSCs來源廣泛，取材對患者無痛苦。而由iPSCs而來的MSCs干細胞（即iPSC-MSCs），不僅增殖能力強，能夠表達MSCs的標志性基因和具備三系分化能力，而且相對于iPSCs其分化方向相對可控，具有較高的生物安全性（致瘤性低）。這些特點使iPSC-MSCs在骨組織工程研究領域具有更大的研究

3、和應用價值。但是，如何在體內、體外環(huán)境下誘導其形成特異骨組織細胞是關鍵問題。由于天然的骨基質是骨/干細胞賴以生存的微環(huán)境，并直接調控
　　著細胞的各種行為，利用精確仿生骨細胞生存微環(huán)境的生物材料支架來誘導iPSC-MSCs的成骨分化，將是一種最為直接有效的調控方式。
　　本研究選取電紡HAp/Col/CTS納米纖維來仿生天然骨基質組成和微-納米結構。其中，HAp是自然骨中主要的無機成分，降解后的鈣離子和磷酸根離子能促進骨組織

4、修復，具有骨傳導性和良好的成骨性能；Col是天然骨基質的主要有機成分，生物相容性優(yōu)良，可與HAp在納米尺度上復合形成HAp/Col復合納米纖維，形成構建多級結構骨組織的基本結構單元；CTS是一種多糖生物大分子，在化學結構上與廣泛存在于胞外基質中的氨基聚糖（GAG）類似，且其生物降解特性可通過?；窟M行調控，一定程度上彌補了Col成分的降解特性不易控制的不足。因此，通過將這三種材料復合制得的納米纖維不僅在組分上與骨基質的組成近似，而且具

5、有聚合材料納米纖維超結構，這為形成具有良好生物相容性、生物活性（如骨傳導性與骨誘導性）以及優(yōu)異的機械強度的高仿生骨組織工程支架提供了可能。理論上推測，我們預期該仿生活性HAp/Col/CTS納米纖維支架將有利于iPSC-MSCs的生長、黏附及向成骨細胞定向分化。
　　為此，在本研究中，我們首先采用原位共沉淀方法合成了HAp/CTS納米復合材料，進而加入15wt％的Col與15 wt％的PEO（均相對于CTS的質量比）并在乙酸水溶液

6、中混合均勻后，在25-30％的濕度和30-35?C的溫度條件下進行電紡絲。通過表征分析發(fā)現，電紡制備的HAp/Col/CTS復合纖維的形貌良好，直徑范圍為190-230 nm，并且HAp在纖維中的分布也比較均勻。同時復合納米纖維中各成分之間
　　存在著較強的相互作用，與純Col相比其熱穩(wěn)定性與力學性能都有所提高，其中分解溫度由純Col的172?C上升至235?C，拉伸強度獲得增強達2.54 MPa，能夠用于骨組織工程支架。

7、　　其次，通過對小鼠源iPSCs先經過擬胚體階段懸浮培養(yǎng)后再進行貼壁誘導，我們獲得了iPSC-MSCs種子細胞。研究發(fā)現，第四代以后的iPSC-MSCs在Nanog, Oct3/4, Sox2這三種多性能基因表達上維持在一個較為平緩的低水平，既可以保證細胞的安全性又使其具備較強的增殖能力。并且該細胞的MSCs標志物CD90, CD29, CD44分別高達99.62％,99.14％,86.12％，而造血干細胞的標志物CD45僅為0.29％

8、。證明iPSC-MSCs既具備iPSCs的同源性強、來源廣、體外分化能力強，又具備MSCs的安全性、中胚層分化性并可定向誘導分化為成骨細胞的特性。因此iPSC-MSCs可作為一種優(yōu)良的種子細胞用于本課題的骨組織工程研究中。
　　接著，對iPSC-MSCs在CTS, HAp/CTS, HAp/Col/CTS納米纖維支架及組織培養(yǎng)板（TCP）上培養(yǎng)不同時間后，我們考察了其形貌特征、細胞增殖、細胞遷移及成骨分化等特性，結果表明：HAp/

9、Col/CTS對iPSC-MSCs具有很強的細胞親和力，能夠促進這些細胞的鋪展與增殖，說明此材料具有良好的細胞相容性。骨相關基因Runx2, Ocn, Alp, Col的高表達如Runx2在HAp/Col/CTS納米纖維膜上的表達量分別是TCP、CTS納米纖維膜與 HAp/CTS納米纖維膜上的3.82、3.29、2.67倍，標志性蛋白（RUNX2與OCN）的高陽性率以及分泌蛋白（ALP與Col）的過量表達均證明該仿生支架材料具有優(yōu)良的成

10、骨誘導性。
　　最后，以小鼠顱骨缺損為實驗動物模型，我們研究了植入iPSC-MSCs復合HAp/Col/CTS仿生納米纖維支架對骨缺損的修復功效。通過雙源CT影像學、骨密度檢測以及HE染色檢測，發(fā)現復合iPSC-MSCs的HAp/Col/CTS仿生納米纖維支架在小鼠顱骨缺損模型中能夠刺激骨組織再生，在植入六周之后該組別的新生骨密度分別是空白對照組、CTS納米纖維組、HAp/CTS納米纖維組與HAp/Col/CTS納米纖維組的3.3

11、5、2.91、2.88和2.14倍，均表現出極顯著性差異（P＜0.01），呈現出最優(yōu)的骨缺損修復效果，證明iPSC-MSCs/HAp/Col/CTS復合體具有突出的修復骨缺損潛力。
　　總之，iPSCs在實現個性化的治療領域有著巨大的優(yōu)勢和潛能，本研究首次利用HAp/Col/CTS納米纖維支架來誘導iPSC-MSCs的成骨分化，結果證明該仿生支架可顯著誘導iPSC-MSCs向成骨細胞分化，促進功能表達，對骨缺損的修復效果明顯，具有